本发明专利技术公开了用于NPC早期诊断的试剂盒。本发明专利技术的检测试剂盒,操作简单,重复性好,具有灵敏度高,特异性好的优点,实验数据表明,gH/gL-IgA以OD值0.63为临界值,其灵敏度和特异性分别为83.7%、82.3%。为鼻咽癌的诊断提供新的高灵敏度与特异性的检测指标,有利于鼻咽癌的早期筛查和诊断。将本发明专利技术的检测试剂盒与现有的VCA-IgA检测结果相结合,特别是与对VCA-IgA阴性患者有较好的诊断价值,可以与VCA-IgA形成互补,减少漏诊,为早期筛查和诊断鼻咽癌提供了一个新途径。
【技术实现步骤摘要】
用于NPC早期诊断的试剂盒
本专利技术涉及一种诊断试剂及离体诊断方法,特别涉及一种用于NPC早期诊断的试剂盒。
技术介绍
鼻咽癌(NPC)为我国最常见的恶性肿瘤之一,多见于我国南方的广东、广西、湖南、福建、江西等省,男性发病率为女性的2~3倍,我国病例报道年龄分布在3~90岁,但30~50岁是高发年龄区。鼻咽癌患者体内不仅存在高滴度抗EB病毒抗体,且其抗体水平随病情发展而变化,一些特异性的血清标志物已在鼻咽癌高发地区被广泛应用于人群筛查及早期诊断中。早在上世纪70年代,免疫荧光法(IFA)检测血清中EBV壳抗原(VCA)和早期抗原(EA)被用于筛查鼻咽癌,而大部分正常人血清中未能检出。这项技术所代表的第一代鼻咽癌血清学检查技术很快成为鼻咽癌筛查的金标准。然而传统免疫荧光法受主观影响大、耗时长、对检测者熟练程度要求高,结果随观察者不同而改变,难以进行质量质控。这些局限性被随之孕育而生的酶联免疫吸附测定(ELISA)所突破,作为第二代鼻咽癌血清学检查技术,ELISA具有更高的准确性,便于实现自动化,运用试剂盒快速进行诊断过程,更适于大规模人群筛查。EB病毒壳抗原VCA用于鼻咽癌高发地区人群筛查及早期诊断,其具有较高的特异性及敏感度,至今VCA-IgAIFA或VCA-IgAELISA仍作为一线的辅助诊断指标。鼻咽癌的三早防治是提高生存率的关键,然而在鼻咽癌中,VCA-IgA阳性率为70-95%,5-30%的鼻咽癌患者无法诊断。黄腾波等采用VCA-IgA联合EA-IgA对广东省内98180名30-59岁人群进行鼻咽癌筛查的前瞻性研究,敏感度为50.9%;Liu等采用VCA-IgA联合EBNA1-IgA对四会市5481名受试者进行筛查,敏感度为75%。VCA-IgA阴性的鼻咽癌患者容易漏诊。因此在临床上联合多指标进行诊断,特别是开发和研究对部分VCA-IgA阴性的患者有诊断价值的指标具有重要临床价值。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供定量EB病毒gH/gL复合体抗体的试剂作为NPC早期诊断试剂的应用。本专利技术的另一个目的在于提供一种NPC早期诊断方法。专利技术人研究发现,gH/gL-IgA抗体水平在鼻咽癌患者和健康人群这两组人群中有显著性统计学差异,ROC曲线分析结果显示,gH/gL-IgA曲线下面积(AUC)为0.893,gH/gL-IgA以OD值0.63为临界值,其灵敏度和特异性分别为83.7%、82.3%。运用间接免疫荧光法(IFA)检测样本血清中EBV壳抗原(VCA)抗体(VCA-IgA)。根据检测结果绘制ROC曲线,并确定临界值:以titer≥1:40为VCA-IgAIFA的Cut-off值,其诊断鼻咽癌的灵敏度为84.6%。在209例鼻咽癌患者中,VCA-IgAIFA诊断鼻咽癌假阴性者共32人,在这32人中,运用gH/gL-IgAELISA进行诊断,构建ROC曲线,发现gH/gL-IgAELISA曲线下面积(AUC)为0.879,32人中25人为gH/gL-IgA阳性,敏感度达78.1%。为鼻咽癌的诊断提供了新的高灵敏度与特异性的检测指标,尤其对VCA-IgA阴性患者有较好的诊断价值,可以与VCA-IgA形成互补,减少漏诊,为早期筛查和诊断鼻咽癌提供了一个新途径。本专利技术所采取的技术方案是:一种鼻咽癌早期诊断或筛查的方法,包括如下步骤:1)获取待测样品;2)直接或间接定量样品中EB病毒gH/gL复合体抗体的量;3)根据检测得到的定量结果,确定待测样品是否为鼻咽癌高风险样品。作为本专利技术的进一步改进,上述方法中使用的待测样品为血清样本、唾液。作为本专利技术的进一步改进,上述方法中,使用ELISA法定量样品中EB病毒gH/gL复合体抗体的量。作为本专利技术的进一步改进,上述方法中,通过绘制ROC曲线确定鼻咽癌高风险的判定标准。作为本专利技术的进一步改进,上述方法中,鼻咽癌高风险的判定标准为ROC曲线的Yuden指数。作为本专利技术的进一步改进,上述方法中,鼻咽癌高风险的判定标准为:以OD值计,EB病毒gH/gL复合体抗体-IgA的OD值高于0.63;其中,OD值的测定方法如下:1)血清样本用样本稀释液以1:100稀释,以100μl/孔加样,37℃中孵育1小时;2)PBST洗板5次,最后一次控干,加入稀释好的HRP标记的羊抗人IgA,100μl/孔,37℃中孵育30min;3)PBST洗板5次。加入显色底物TMB,100μl/孔,37℃中孵育30min;4)加入100μl2MH2SO4终止反应;5)终止反应后10min内酶标仪上(450nm)测定OD值。作为本专利技术的进一步改进,上述方法中,待测样品来自鼻咽癌VCA-IgA阴性的患者。本专利技术的有益效果是:本专利技术的检测试剂盒,操作简单,重复性好,具有灵敏度高,特异性好的优点,实验数据表明,gH/gL-IgA以OD值0.63为临界值,其灵敏度和特异性分别为83.7%、82.3%。为鼻咽癌的诊断提供新的高灵敏度与特异性的检测指标,有利于鼻咽癌的早期筛查和诊断。将本专利技术的检测试剂盒与现有的VCA-IgA检测结果相结合,特别是对VCA-IgA阴性患者有较好的诊断价值,可以与VCA-IgA形成互补,减少漏诊,为早期筛查和诊断鼻咽癌提供了一个新途径。附图说明图1是表达产物gH/gL复合体的SDS-PAGE(左)和anti-flag作为一抗的Western-blot(右)检测结果,gH分子量大小为85KDa,gL分子量大小为26Kda;图2是表达产物gH/gL-IgAOD值在鼻咽癌患者(NPC)与健康对照组(Control)分布的散点分布图;图3是鼻咽癌患者(NPC)与健康对照组(Control)检测gH/gL-IgA结果进行ROC分析的结果;图4是gH/gL-IgAELISA诊断VCA-IgAIFA阴性患者的ROC曲线。具体实施方式EB病毒糖蛋白gH(gp85)和gL以异质二聚体的形式存在,含量在糖蛋白中仅次于gp350,作为膜抗原主要成分之一,表达于EB病毒裂解期,与病毒的毒力、宿主范围、组织嗜性、膜融合密切相关。其他类型疱疹病毒的糖蛋白gH此前已被多次报道可诱发免疫反应。例如,水痘带状疱疹病毒糖蛋白复合体gH/gL包含可以与人类免疫球蛋白IgG的γ链反应的区域结构;杆状病毒系统表达重组纤维乳头状瘤相关疱疹病毒糖蛋白gH采用ELISA成功应用于诊断海龟的纤维乳头状瘤中。但是由于NPC的致病机理并不十分明确,未有任何实验数据显示EB病毒糖蛋白复合体gH/gL与NPC的进展具有相关性。一种鼻咽癌早期诊断或筛查的方法,包括如下步骤:1)获取待测样品;2)直接或间接定量样品中EB病毒gH/gL复合体抗体的量;3)根据检测得到的定量结果,确定待测样品是否为鼻咽癌高风险样品。血清样本易于制备,处理难度低,作为本专利技术的进一步改进,上述方法中使用的待测样品为血清样本。当然,也可以使用其他临床样本,如唾液等其他人体样本。直接定量EB病毒gH/gL复合体抗体的量,可以通过添加EB病毒gH/gL复合体,之后使用ELISA法定量。间接定量EB病毒gH/gL复合体抗体的量,可以通过与定量EB病毒gH/gL复合体抗体表达量相关产物的量来确定,如其mRNA表达量,或其产物。作为本专利技术的进一步改进,上述方法中,使用本文档来自技高网...
【技术保护点】
定量EB病毒gH/gL复合体抗体的试剂作为鼻咽癌早期诊断或筛查试剂的应用,定量EB病毒gH/gL复合体抗体的试剂包括直接或间接定量EB病毒gH/gL复合体抗体的试剂。
【技术特征摘要】
1.定量EB病毒gH/gL复合体IgA抗体的试剂在制备鼻咽癌早期诊断或筛查试剂中的应用,定量EB病毒gH/gL复合体IgA抗体的试剂包括直接或间接定量EB病毒gH/gL...
【专利技术属性】
技术研发人员:曾木圣,黄晓明,李瑞辰,杜勇,张星,韩萍,钟茜,李满枝,刘万里,
申请(专利权)人:中山大学附属肿瘤医院,
类型:发明
国别省市:广东;44
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