本发明专利技术公开了一种基于荧光定量PCR技术的奶牛早期妊娠检测试剂盒及检测方法，通过联合检测奶牛外周血中两个干扰素刺激基因ISG15和RSAD2的表达量来进行妊娠诊断，可以在青年母牛人工授精后18d排查空怀牛和妊娠牛，使妊娠诊断的时间提前；可实现在青年母牛第一次配种后3周以内排查空怀牛，对其进行再次人工授精，从而缩短产犊至下一次妊娠的间隔，进而提高奶牛的繁殖率。本发明专利技术的试剂盒及其检测方法，操作简单，出结果快，检测结果准确，灵敏度高，有望成为今后奶牛业中早期妊娠诊断的主流技术。
【技术实现步骤摘要】
奶牛早期妊娠的荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法
本专利技术涉及分子生物学和核酸检测
，具体的说，本专利技术涉及一种基于荧 光定量PCR技术的奶牛早期妊娠检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
妊娠诊断是奶牛生产管理中的重要环节，对奶牛实施早期妊娠诊断可以尽早发现 空怀牛并对其进行发情处理和再次人工授精，可缩短产犊间隔、减少空怀导致的经济损失。 根据国内外专家估计，空怀导致每头乳牛每日约减奶8-15千克；最低少生产牛犊0. 003头， 每头每日饲料、能源、人力等方面的消耗约20-30元。因此，探索科学、准确、简便、快捷的奶 牛早期妊娠诊断新技术显得尤为重要。 在生产中常见最常用的妊娠诊断方法是直肠触诊，技术比较成熟的繁殖员在配 种后45-50d可做出准确诊断，经验丰富的繁殖员最早可以在人工授精后35d判断是否妊 娠；通过测定牛奶或者血液中的孕酮含量也可以判断奶牛是否受孕，该方法在人工授精 后21-24d进行检测；目前已经开始初步使用但是尚未广泛推广的牛妊娠相关蛋白（PAG) ELISA试剂盒能在妊娠后28d做出较为可靠的判断。由此可见，这些方法均只能在奶牛 人工授精三周后做出准确诊断。最新的研究报道证实利用PAGELISA试剂盒于人工授精 后28d排查出来的空怀牛，与同样条件下在妊娠46d时利用直肠检查的方法排查出来的 空怀牛相比，对其实施同期发情并再次配种后的妊娠率和空怀天数并没有提高（Sinedino LD，LimaFS,BisinottoRS，etal.Effectofearlyorlateresynchronization basedondifferentmethodsofpregnancydiagnosisonreproductiveperformance ofdairycows[J].Journalofdairyscience，2014, 97 (8): 4932-41) ?研究指出，如果 人工授精后一个情期内（三周）能排查出空怀牛，即可对其进行快速的同期发情处理，在 第21-23d进行复配，减少空怀天数，提高奶牛的繁殖效率（LucyMC，McDougallS，Nation DP.Theuseofhormonaltreatmentstoimprovethereproductiveperformanceof lactatingdairycowsinfeedlotorpasture-basedmanagementsystems[J].Animal reproductionScience, 2004, 82-83:495-512)。因此，从某种程度上来讲，能否于奶牛人工 授精后一个情期内判断奶牛妊娠或者空怀，是缩短奶牛产犊间隔和提高繁殖率的关键。 综上，需要能够实现快速、有效且准确检测奶牛早期妊娠的产品，以尽早发现空怀 牛并对其进行发情处理和再次人工授精，缩短产犊间隔、减少空怀导致的经济损失。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种特异性好、灵敏度高、准确地检测奶牛早期妊娠的荧 光定量RT-PCR的方法，以较早时间判断出青年牛人工授精后是否妊娠。 牛早期胚胎发育的过程中，在授精后14-18d即母体妊娠识别阶段，孕体合成并分 泌的干扰素-t(IFN-t)可作用于血液中白细胞，引起一系列干扰素刺激基因上调表达， 因此，通过定量PCR技术检测白细胞中这些干扰素刺激基因的表达水平可以进行妊娠诊 断。本专利技术通过荧光定量PCR技术检测奶牛人工授精后18d外周血白细胞中干扰素刺激基 因的表达水平来进行妊娠诊断，实现在奶牛人工授精后一个情期内判别妊娠牛和空怀牛。 为空怀牛的复配节约时间，从根本上提高奶牛的繁殖效率。 该荧光定量RT-PCR检测方法包括如下步骤（步骤示意如图1): (1)血液标本的收集 采集青年牛（14-16月龄的奶牛）发情后人工授精前0d和人工授精后18d的外周 血1. 5-2ml，抗凝，低温冷藏。 ⑵标本RNA的提取 血液总RNA提取试剂盒提取标本中总RNA(标本采集后2h内完成），之后利用 NanoDrop2000超微量分光光度计分析RNA样本浓度与纯度（0D26CI/28CI = 1. 9-2. 1)，同时采 用1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，通过质检的样本分装后，于-80°C保存备用。 (3)逆转录反应 逆转录采用试剂盒进行，每个反应RNA用量为500ng，根据RNA的浓度计算得出每 次反应所需的体积，按照试剂盒说明书进行。 (4)荧光定量PCR检测ISG15和RSAD2基因在青年牛外周血中的相对表达量 1)目的基因和内参基因引物的设计与合成 牛ISG15基因和内参基因P-Actin引物参考文献报道（GiffordCA，Racicot K,ClarkDS,etal.RegulationofInterferon-StimulatedGenesinPeripheralBlood LeukocytesinPregnantandBred,NonpregnantDairyCows[J].Journalofdairy science, 2007, 90:274-280)，其中，所述的牛ISG15 基因的引物对是：SEQIDNO:1 和SEQ IDNO:2, 0 -Actin的引物对是：SEQIDNO:3和SEQIDNO:4,具体的引物信息如下： ISG15-F:5 ; -GGTATCCGAGCTGAAGCAGTT-3 ; ISG15-R:5 ; -ACCTCCCTGCTGTCAAGGT-3 ; @-Actin-F:5 ' -CTGGACTTCGAGCAGGAGAT-3 ' P-Actin-R:5 ' -GGATGTCGACGTCACACTTC-3 ' 牛RSAD2基因引物对序列根据NCBI中提供的牛RSAD2基因序列（NM_001045941)， 利用软件Primer5.0设计。所用引物序列如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示，具体的引 物对序列为： RSAD2-F:5 ' -GCTGAAAGAAGCAGGTATGGA-3 ' RSAD2-R:5 ' -CGTACTTCTGGAACCACCTCT-3 ' 2)荧光定量PCR反应体系 牛ISG15和RSAD2基因荧光定量PCR扩增体系均为：2xSYBR?Green10iil， 上下游引物各 〇? 5ill(10iimol/L)，cDNA模板 0? 3iil，ddH20 8. 7iil，体系共 20ill。 3)荧光定量PCR反应条件 15615基因反应条件：951：预变性6〇8,951：变性158,621：退火158 ;721：延伸 30s，共40个循环 1?402基因反应条件：951：预变性6〇8,951：变性158,581：退火158 ;721：延伸 30s，共40个循环 0-Actin基因反应条件：95°C预变性 60s，95°C变性 15s，60-62°C退火 15s;72°C 延伸30s，共40个循环 (5)统计分析 1)ISG15和RSAD2基因表达量的分析 采用相对定量本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于荧光定量PCR技术的奶牛早期妊娠检测试剂盒，包含牛ISG15基因和内参基因β‑Actin特异性引物对，其中，所述的牛ISG15基因的引物对是：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，β‑Actin的引物对是：SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，其特征在于还包含牛RSAD2基因特异性引物对，所用引物序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。
【技术特征摘要】
1. 一种基于荧光定量PCR技术的奶牛早期妊娠检测试剂盒，包含牛ISG15基因和内参 基因 P-Actin特异性引物对，其中，所述的牛ISG15基因的引物对是：SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2，@-Actin的引物对是：SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4,其特征在于还包含牛RSAD2 基因特异性引物对，所用引物序列如SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6所示。2. 如权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述试剂盒的统一浓度和1人份测试用量统 一标准为： ISG15-F lOumol/L 0. 5 u L ISG15-R lOumol/L 0. 5 u L RSAD2-F lOumol/L 0. 5 u L RSAD2-R lOumol/L 0. 5 u L ^-Actin-F lOumol/L 0. 5 u L 3-Actin-R IOu mol/L 0.5 u L。3. -种基于荧光定量PCR技术的奶牛早期妊娠检测方法，包括如下步骤： (1) 血液标本的收集 采集奶牛发情后人工授精前Od和人工授精后18d的外周血I. 5-2ml，抗凝，低温冷藏； (2) 标本RNA的提取 标本采集后2h内用血液总RNA提取试剂盒完成标本中总RNA提取，之后利用NanoDrop 2000超微量分光光度计分析RNA样本浓度与纯度，0D26(I/28(I = 1. 9-2. 1，同时采用1. 2%琼脂 糖凝胶电泳检测RNA完整性，通过质检的样本分装后，于-80°C保存备用； (3) 逆转录反应 逆转录采用试剂盒进行，每个反应RNA用量为500ng，根据RNA的浓度计算得出每次反 应所需的体积，按照试剂盒说明书进行； (4) 荧光定量PCR检测ISG15和RSAD2基因在奶牛外周血中的相对表达量 1) 目的基因和内参基因引物的设计与合成 牛IS...
【专利技术属性】
技术研发人员：程蕾，向敏，王定发，刘晓华，胡修忠，夏瑜，凌明湖，
申请(专利权)人：武汉市畜牧兽医科学研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。