本发明专利技术涉及一种转Bt基因抗虫水稻对捕食性天敌青翅蚁形隐翅甲安全性评价方法,由三级营养试验，蛋白传递规律，Tier-1毒性测定试验3个部分组成。各部分分别评价转Bt基因抗虫水稻通过猎物介导对青翅蚁形隐翅甲的影响；评价青翅蚁形隐翅甲暴露于Bt蛋白的途径和程度；评价转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白对青翅蚁形隐翅甲的潜在毒性。最终，根据3个方面的数据综合评价所述转Bt基因抗虫水稻对该非靶标生物产生的生态后果。本发明专利技术建立了一套系统、科学的评价方法，对完善转Bt基因作物对非靶标生物的影响研究以及确定转Bt基因作物种植的生态安全性具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
转Bt基因抗虫水稻对捕食性天敌青翅蚁形隐翅甲安全性 评价方法
本专利技术属于转Bt基因作物生态风险评价
，具体涉及一种转Bt基因抗虫 水稻对捕食性天敌青翅蚁形隐翅甲安全性评价方法。
技术介绍
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，但同时也是虫害最多的粮食作物之一，每 年虫害造成的产量损失约为10% (陈浩等，2009)。其中鳞翅目害虫为最主要害虫类群 之一，特别是稻纵卷叶螟、二化螟和三化螟等为害严重威胁水稻生产。目前对鳞翅目害虫 的防治主要依赖化学杀虫剂，化学杀虫剂不紧提高了生产成本，而且造成了严重的环境 污染，并且随着杀虫剂的广泛使用，害虫产生了越来越高的抗性，这就又引起了杀虫剂越 来越多的使用，因此导致了害虫抗性（Resistance)、农药残留（Residue)和害虫再娼獗 (Resurgence) 3R问题，形成恶性循环。因此高抗鳞翅目的抗性品种是一种经济、有效、环保 的防治手段。然而，在水稻及野生稻中，难以找到高抗鳞翅目昆虫的抗源。要培育高抗鳞翅 目害虫的水稻品种，需借助于外源抗虫基因 。Bacillus thuringiensis (Bt)杀虫蛋白被用 作生物源杀虫剂已经有五十多年的历史，对鳞翅目害虫有稳定的防治效果。目前是转Bt基 因抗虫水稻是控制鳞翅目害虫的主要抗虫水稻。 转基因抗虫植物的利用是作物害虫防治技术的一次巨大绿色变革，但其为人类带 来利益的同时，也可能对环境造成潜在的生态风险，近20年来，国内外已经开展了大量的 实验室和田间试验来评价转基因植物的安全性，其中，转基因抗虫植物对非靶标生物安全 性一直是相关研究者关注的焦点。目前，国际上的风险评价工作者以及转基因植物相关 管理部门广泛采用分层次评价体系开展转基因植物对非靶标生物影响方面的研究工作 (Romeis et al. ,2008;王圆圆等，2011)。该评价体系就是选择合适的受试生物，然后依次 开展从实验室试验到半田间试验，再到田间试验分层次分阶段进行的系统评价。 褐飞風Nilaparvata lugens (St&l)是温带和热带水稻田间最主要的害虫之一，是 转Bt基因水稻种植过程中重要的非靶标植食性昆虫。青翅蚁形隐翅甲（Paederus fuscipes Curtis)是水稻重要天敌，尤其在早稻中、后期对稻飞虱种群的增长起着明显抑制作用（罗 肖南等，1990)。其通过捕食过程能够摄取到Bt蛋白，有存在生态风险的可能性，那么，建立 一套系统评价转Bt基因抗虫水稻对青翅蚁形隐翅甲的安全性尤为重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述现状，旨在提供一种安全有效、操作简便、成本低廉的转 Bt基因抗虫水稻对捕食性天敌青翅蚁形隐翅甲安全性评价方法。 本专利技术目的的实现方式为，转Bt基因抗虫水稻对捕食性天敌青翅蚁形隐翅甲安 全性评价方法，包括如下三个部分： (1)三级营养试验：通过水稻一褐飞虱一青翅蚁形隐翅甲的食物链评价转Bt基因 抗虫水稻通过猎物介导对青翅蚁形隐翅甲的安全性影响； 转基因组：取24h内孵化的青翅蚁形隐翅甲一龄幼虫，单头接入底部吸水海绵保 湿的指形管内，置于温度28°C，光周期L: D = 12:12h，相对湿度65 % -80 %的智能人工气候 箱内培养，每管每天饲喂2-3龄转Bt基因抗虫水稻品系上饲养的褐飞虱9-10头，并在青翅 蚁形隐翅甲幼虫一龄第二天，二龄第二天每管每头补充一头果蝇成虫； 对照组，水稻品系为非转基因水稻品系，其它同转基因组； 每个指形管内各接青翅蚁形隐翅甲幼虫1头，每组共80头，每天上午观察记录青 翅蚁形隐翅甲幼虫的存活和蜕皮情况，直至幼虫羽化，初羽化成虫24h内用万分之一电子 天平称重； 羽化24h的青翅蚁形隐翅甲成虫雌雄配对后，饲养于底部铺有湿润滤纸和湿润棉 花的塑料培养皿内，每皿一对，每天每塑料培养皿饲喂相应水稻品系上的褐飞虱15头，每 天上午观察记录青翅蚁形隐翅甲成虫所产卵粒数； 将卵粒用毛笔挑入内置湿润棉球的24孔细胞培养板内，每孔一粒卵，每天上午观 察记录青翅蚁形隐翅甲卵的孵化数目，测定65d ; 选择青翅蚁形隐翅甲的幼虫发育历期、幼虫存活率、雌性率以及初羽化体重、青翅 蚁形隐翅甲成虫产卵前期、产卵量、卵孵化率作为评价参数指标，并进行统计分析，评价由 褐飞虱若虫介导的转Bt基因抗虫水稻对青翅蚁形隐翅甲的安全性影响； (2)蛋白传递规律：通过ELISA检测手段鉴定青翅蚁形隐翅甲暴露于转Bt基因抗 虫水稻所表达Bt蛋白的途径和程度； 于2000ml玻璃罐中分别放入15日龄转基因水稻品系和非转基因水稻品系的稻 苗，接入对应材料饲养的褐飞虱1龄若虫，待褐飞虱2-3龄时分别取水稻叶鞘和褐飞虱若 虫；水稻叶鞘组织取样30 ± lmg，褐飞風若虫取样约35 ± Img ;每组处理重复3次； 以不同组的稻苗饲养的2-3龄褐飞虱若虫饲养青翅蚁形隐翅甲幼虫直至羽化，对 24h内的初羽化青翅蚁形隐翅甲成虫取样约35 ±2mg，每组处理重复3次； 采用ELISA技术，分别对以上转基因水稻品系样品中Bt蛋白的含量进行检测，确 定通过食物链青翅蚁形隐翅甲暴露于转Bt基因抗虫水稻所表达Bt蛋白的程度； (3)Tier_l毒性测定试验：评价转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白对非靶标生物 青翅蚁形隐翅甲的潜在毒性； 用塑料培养皿饲养48h内孵化的青翅蚁形隐翅甲一龄幼虫，培养皿底部放置厚度 1±0. 5cm的湿润基质土壤； 用三种形式的人工饲料搭配非转基因水稻品系上饲养的1-2龄褐飞虱若虫为青 翅蚁形隐翅甲幼虫的饲料，三种形式的饲料为：人工饲料、人工饲料与褐飞虱、添加转Bt基 因抗虫水稻叶鞘组织Bt蛋白表达量的10倍以上剂量的饲料及褐飞虱与含有lmg/g砷酸二 氢钾的人工饲料；每个塑料培养皿中各接青翅蚁形隐翅甲幼虫1头，每个处理共75头，每日 更换饲料并观察记录青翅蚁形隐翅甲蜕皮及存活情况，直至羽化，初羽化成虫在24h内用 万分之一电子天平称重； 添加褐飞虱是在青翅蚁形隐翅甲幼虫取食人工饲料第6、7、8三天补充； 所述人工饲料是伊威全机能肝粉与蜂蜜的混合物； 试验中通过ELISA和敏感昆虫生测技术全程监测Bt蛋白的浓度、稳定性以及生物 活性； 选择青翅蚁形隐翅甲的幼虫发育历期、幼虫存活率、雌性率以及初羽化体重作为 评价参数指标，对其进行统计分析，以评价转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白对青翅蚁形隐 翅甲的毒性影响； 最终，根据三个方面的研究数据综合分析转Bt基因抗虫水稻的种植对该非靶标 生物产生的生态后果。 本专利技术建立了一套系统、科学、安全有效、操作简便、成本低廉的评价方法，对完善 转Bt基因抗虫水稻对非靶标生物的影响研究具有重要意义，对确定转Bt基因抗虫水稻种 植的生态安全性具有重要意义。 【附图说明】 图1为T1C-19水稻叶鞘组织，2-3龄期褐飞虱若虫及取食褐飞虱若虫的青翅蚁形 隐翅甲体内CrylC蛋白含量图， 图2为以转crylC水稻品系上饲养的褐飞虱若虫为猎物的青翅蚁形隐翅甲日产卵 图， 图3为取食人工饲料以及加入CrylC蛋白与PA人工饲料的本文档来自技高网...
【技术保护点】
转Bt基因抗虫水稻对捕食性天敌青翅蚁形隐翅甲安全性评价方法，其特征在于包括如下三个部分：(1)三级营养试验：通过水稻—褐飞虱—青翅蚁形隐翅甲的食物链评价转Bt基因抗虫水稻通过猎物介导对青翅蚁形隐翅甲的安全性影响；转基因组：取24h内孵化的青翅蚁形隐翅甲一龄幼虫，单头接入底部吸水海绵保湿的指形管内，置于温度28℃，光周期L:D＝12:12h，相对湿度65％‑80％的智能人工气候箱内培养，每管每天饲喂2‑3龄转Bt基因抗虫水稻品系上饲养的褐飞虱9‑10头，并在青翅蚁形隐翅甲幼虫一龄第二天，二龄第二天每管每头补充一头果蝇成虫；对照组，水稻品系为非转基因水稻品系，其它同转基因组；每组在指形管内各接青翅蚁形隐翅甲幼虫80头，每天上午观察记录青翅蚁形隐翅甲幼虫的存活和蜕皮情况，直至幼虫羽化，初羽化成虫24h内用万分之一电子天平称重；羽化24h后的青翅蚁形隐翅甲成虫雌雄配对，饲养于底部铺有湿润滤纸和湿润棉花的塑料培养皿内，每皿一对，每天每塑料培养皿饲喂相应水稻品系上的褐飞虱15头，每天上午观察记录青翅蚁形隐翅甲成虫所产卵粒数，测定65d；将卵粒用毛笔挑入内置湿润棉球的24孔细胞培养板内，每孔一粒卵，每天上午观察记录青翅蚁形隐翅甲卵的孵化数目；选择青翅蚁形隐翅甲的幼虫发育历期、幼虫存活率、雌性率以及初羽化体重、青翅蚁形隐翅甲成虫产卵前期、产卵量、卵孵化率作为评价参数指标，并进行统计分析，评价由褐飞虱若虫介导的转Bt基因抗虫水稻对青翅蚁形隐翅甲的安全性影响；(2)蛋白传递规律：通过ELISA检测手段鉴定青翅蚁形隐翅甲暴露于转Bt基因抗虫水稻所表达Bt蛋白的途径和程度；于2000ml玻璃罐中分别放入15日龄转基因水稻品系和非转基因水稻品系的稻苗，接入对应材料饲养的褐飞虱1龄若虫，待褐飞虱2‑3龄时分别取水稻叶鞘和褐飞虱若虫；水稻叶鞘组织取样30±1mg，褐飞虱若虫取样35±1mg；每组处理重复3次；以不同组的稻苗饲养的2‑3龄褐飞虱若虫饲养青翅蚁形隐翅甲幼虫直至羽化，对24h内的初羽化青翅蚁形隐翅甲成虫取样35±2mg，每组处理重复3次；采用ELISA技术，分别对以上转基因水稻品系样品中Bt蛋白的含量进行检测，确定通过食物链青翅蚁形隐翅甲暴露于转Bt基因抗虫水稻所表达Bt蛋白的程度；(3)Tier‑1毒性测定试验：评价转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白对非靶标生物青翅蚁形隐翅甲的潜在毒性；用塑料培养皿饲养48h内孵化的青翅蚁形隐翅甲一龄幼虫，培养皿底部放置厚度1±0.5cm的湿润基质土壤；用三种形式的人工饲料搭配非转基因水稻品系上饲养的1‑2龄褐飞虱若虫为青翅蚁形隐翅甲幼虫的饲料，三种形式的饲料为：人工饲料、人工饲料与褐飞虱、添加转Bt基因抗虫水稻叶鞘组织Bt蛋白表达量的10倍以上剂量的饲料及褐飞虱与含有1mg/g砷酸二氢钾的人工饲料；每个培养皿接青翅蚁形隐翅甲幼虫1头，每个处理共75头，每日更换饲料并观察记录青翅蚁形隐翅甲蜕皮及存活情况，直至羽化，初羽化成虫在24h内用万分之一电子天平称重；添加褐飞虱是在青翅蚁形隐翅甲幼虫取食人工饲料第6、7、8三天补充；所述人工饲料是伊威全机能肝粉与蜂蜜的混合物；试验中通过ELISA和敏感昆虫生测技术全程监测Bt蛋白的浓度、稳定性以及生物活性；选择青翅蚁形隐翅甲的幼虫发育历期、幼虫存活率、雌性率以及初羽化体重作为评价参数指标，对其进行统计分析，以评价转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白对青翅蚁形隐翅甲的毒性影响；最终，根据三个方面的研究数据综合分析转Bt基因抗虫水稻的种植对该非靶标生物产生的生态后果。...
【技术特征摘要】
1.转Bt基因抗虫水稻对捕食性天敌青翅蚁形隐翅甲安全性评价方法，其特征在于包 括如下三个部分： (1) 三级营养试验：通过水稻一褐飞風一青翅蚁形隐翅甲的食物链评价转Bt基因抗虫 水稻通过猎物介导对青翅蚁形隐翅甲的安全性影响； 转基因组：取24h内孵化的青翅蚁形隐翅甲一龄幼虫，单头接入底部吸水海绵保湿的 指形管内，置于温度28°C，光周期L: D = 12:12h，相对湿度65 % -80 %的智能人工气候箱内 培养，每管每天饲喂2-3龄转Bt基因抗虫水稻品系上饲养的褐飞虱9-10头，并在青翅蚁形 隐翅甲幼虫一龄第二天，二龄第二天每管每头补充一头果蝇成虫； 对照组，水稻品系为非转基因水稻品系，其它同转基因组； 每组在指形管内各接青翅蚁形隐翅甲幼虫80头，每天上午观察记录青翅蚁形隐翅甲 幼虫的存活和蜕皮情况，直至幼虫羽化，初羽化成虫24h内用万分之一电子天平称重； 羽化24h后的青翅蚁形隐翅甲成虫雌雄配对，饲养于底部铺有湿润滤纸和湿润棉花的 塑料培养皿内，每皿一对，每天每塑料培养皿饲喂相应水稻品系上的褐飞虱15头，每天上 午观察记录青翅蚁形隐翅甲成虫所产卵粒数，测定65d ; 将卵粒用毛笔挑入内置湿润棉球的24孔细胞培养板内，每孔一粒卵，每天上午观察记 录青翅蚁形隐翅甲卵的孵化数目； 选择青翅蚁形隐翅甲的幼虫发育历期、幼虫存活率、雌性率以及初羽化体重、青翅蚁形 隐翅甲成虫产卵前期、产卵量、卵孵化率作为评价参数指标，并进行统计分析，评价由褐飞 虱若虫介导的转Bt基因抗虫水稻对青翅蚁形隐翅甲的安全性影响； (2) 蛋白传递规律：通过ELISA检测手段鉴定青翅蚁形隐翅甲暴露于转Bt基因抗虫水 稻所表达Bt蛋白的途径和程度； 于2000ml玻璃罐中分别放入15日龄转基因水稻品系和非转基因水稻品系的稻苗，接 入对应材料饲养的褐飞虱1龄若虫，待褐飞虱2-3龄时分别取水稻叶鞘和褐飞虱若虫；水稻 叶鞘组织取样30 ± lmg，褐飞風若虫取样35 ± Img ;每组处理重复3次； 以不同组的稻苗饲养的2-3龄褐飞虱若虫饲养青翅蚁形隐翅甲幼虫直至羽化，对24h 内的初羽化青翅蚁形隐翅甲成虫取样35 ±2mg，每组处理重复3次； 采用ELISA技术，分别对以上转基因水稻品系样品中Bt蛋白的含量进行检测，确定通 过食物链青翅蚁形隐翅甲暴露于转Bt基因抗虫水稻所表达Bt蛋白的程度； (3) Tier-I毒性测定试验：评价转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白对非靶标生物青翅 蚁形隐翅甲的潜在毒性； 用塑料培养皿饲养48h内孵化的青翅蚁形隐翅甲一龄幼虫，培养皿底部放置厚度 1±0. 5cm的湿润基质土壤； 用三种形式的人工饲料...
【专利技术属性】
技术研发人员：华红霞，孟嘉蓉，韩宇，吴刚，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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