本发明专利技术公开一种非洲猪瘟病毒VP73蛋白小鼠腹水多克隆抗体的制备方法，旨在提供一种腹水效价高，亲和力高，抗原用量少、操作简便的新型多克隆抗体的制备方法。所述的非洲猪瘟病毒多克隆抗体的制备包括：对ASFV VP73基因序列PCR扩增、抗原的制备、动物免疫、腹水多克隆抗体提取的步骤。本发明专利技术提供的非洲猪瘟病毒VP73蛋白多克隆抗体与常规兔源、鼠源抗血清的制备方式相比，该制备方式具有抗原用量少、操作简便,非洲猪瘟病毒VP73蛋白小鼠腹水多克隆抗体可以用于非洲猪瘟病毒VP73抗体的检测，为我国非洲猪瘟病的防控提供重要的技术手段。
【技术实现步骤摘要】
非洲猪瘟病毒VP73蛋白特异性多克隆抗体的制备方法及 应用
本专利技术涉及基因工程技术和免疫学
，具体涉及抗非洲猪瘟病毒抗原性结 构蛋白VP73蛋白特异性腹水多克隆抗体，以及制备方法和用途。 非洲猪癌（African swine fever, ASF)主要是由非洲猪癌病毒（African swine fever virus，ASFV)引起的猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，是世界动物卫生组织 (OIE)规定的法定报告动物疫病。临床上以高热、皮肤充血、内脏器官出血、高死亡率为特 征。非洲猪瘟自1921由肯尼亚首次报道以来，已蔓延至非洲、欧洲、美洲加勒比海地区和欧 亚接壤地区的49个国家。无论在非洲猪瘟新发地区还是流行地区，疫情的爆发和流行都会 对发病国家产生严重的社会经济影响。非洲猪瘟虽然不感染人，但对于那些把猪肉及其相 关猪制品作为主要动物蛋白来源的国家，非洲猪瘟的流行大大降低了猪产品的供应能力， 改变当地居民的饮食结构，间接对人体健康造成危害。 ASFV属于双链DNA病毒目（dsDNA)、非洲猪瘟病毒科（Asfarviridae)、非洲猪瘟 病毒属（Asfivirus)，而且是其唯一已知的代表物种。ASFV有囊膜呈二十面体对称，平均直 径200nm，结构复杂。基因组约为170-192kb，与痘病毒相似，具有发夹结构、末端反向重复 序列以及早期RNA合成所必需的酶。整个基因组有151个0RF，其编码的蛋白中有131种病 毒蛋白的结构和功能已有报道。 ASFV可以编码34种以上的结构蛋白，VP73蛋白作为ASFV主要的抗原性结构蛋 白，包含396个氨基酸，分子量约为44. 8KDa，抗原性稳定，能够诱导机体产生中和抗体，选 择ASFV VP73蛋白作为免疫原制备特异性的单克隆抗体、多克隆抗体，从而建立ELISA、免 疫印迹技术、间接免疫荧光等方法来检测ASF具有明显的优势性。 2007年至2014年7月，越来越多的国家遭受到非洲猪瘟的侵袭，先后在格鲁吉亚、 亚美尼亚、阿塞拜疆、俄罗斯、乌克兰、白俄罗斯等国暴发，造成巨大的经济损失，也严重威 胁我国的养猪业。俄罗斯：6月20日-7月8日在卡卢加州、斯摩棱斯克州、普斯科夫州、诺 夫哥罗德州发生12起非洲猪瘟疫情，发病野猪5头，病死野猪4头，野猪病死率80%，扑杀 野猪1头；发病猪34头，病死猪23头，病死率67. 65%。拉托维亚：7月2日-13日发生11 起非洲猪瘟疫情，发病野猪10头，病死野猪9头，销毁野猪1头；发病猪4头，扑杀猪47头。 波兰：6月-7月在波德拉谢省发生4非洲起猪瘟疫情，发病野猪12头，病死野猪12头。立 陶宛：2014年7月底，在立陶宛伊格纳利纳区一家大型农场发现大规模非洲猪瘟疫情，该农 场约2万头猪都被宰杀，以防止疫情扩散。8月，立陶宛又在乌泰纳区一家私人农场发现非 洲猪瘟疫情。 随着非洲猪瘟流行的区域在逐渐扩大并有蔓延至我国的风险，已经引起我国的兽 医工作者们的高度重视并开展相关储备性研究，针对ASFV相关基因的多克隆抗体的制备 已有相关报道，多是采用将抗原免疫兔或大鼠收获抗血清，如李洪利等（2012)利用原核表 达的VP73蛋白免疫新西兰大白兔获得抗VP73蛋白多克隆抗体的高免血清；如何提供一种 快速、经济、特异性良好的多克隆抗体制备方法无疑会加速我国对非洲猪瘟免疫学研究以 及及早的建立非洲猪瘟血清学检测方法奠定基础。 目前，实验室制备多克隆抗体一般采用将提纯的病毒核芯颗粒或表达抗原免疫大 白兔或大鼠后获得相应的兔源、鼠源的抗血清多克隆抗体，但未见利用腹水制备多克隆抗 体的制备方法。本专利技术首次提出了抗ASFV VP73蛋白腹水多克隆抗体的制备，制备的腹水多 克隆抗体特异性效果等同于常规抗血清制备方法获得的多克隆抗体，但与常规方法相比， 腹水多克隆抗体的制备有着抗原用量少、经济、易操作、腹水可反复抽取等优点，制备的腹 水多克隆抗体已通过本实验在Western blot、ELISA等检测技术上成功应用。制备的ASFV VP73蛋白腹水多抗能与VP73原核表达蛋白发生特异性结合，而对照无蛋白带出现，说明所 获得的多抗对VP73原核表达蛋白具有良好的特异性。因此，腹水多克隆抗体的制备方法可 以代替常规抗血清制备多克隆抗体方法，不仅对研究ASFV VP73蛋白的功能有重大意义，而 且对建立特异、敏感、快速的ASFV免疫学检测方法（如ELISA)也有重要的意义。 【
技术实现思路
】 本专利技术的目的在于，提供一种经济、易操作、抗体特性好的抗ASFV VP73蛋白腹水 多克隆抗体的制备方法。腹水多克隆抗体的制备方法可以代替常规抗血清制备多克隆抗体 方法。 本专利技术的内容涉及一种非洲猪瘟病毒VP73蛋白的特异性多克隆抗体的制备方 法，包括如下步骤： a)制备VP73蛋白重组抗原：将VP73基因序列扩增至原核表达载体GEX-KG中，转 化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，诱导表达获得重组蛋白抗原； b)动物免疫：取步骤a)获得的重组蛋白抗原30 μ g与等体积的弗氏完全佐剂充 分乳化制成免疫原，选择8周龄雌性Balb/c小鼠，分别在第1、15、30天对小鼠进行第一、 二、三次免疫； c)加强免疫：取步骤a)获得的重组蛋白抗原30 μ g作为免疫原，在步骤b)中第 三次免疫后45天,对小鼠进行免疫； d)对步骤c)加强免疫7天后的小鼠，腹腔注射0.5ml降植烷，7天后，接种IXlO5 个SP2/0细胞； e)步骤d)接种P2/0细胞7?10天后采集腹水，腹水中含有所述非洲猪瘟病毒 VP73蛋白的特异性多克隆抗体。 本专利技术的内容还包括根据方法制备获得的非洲猪瘟病毒VP73蛋白的特异性多克 隆抗体。 本专利技术的内容还包括所述的非洲猪瘟病毒VP73蛋白的特异性多克隆抗体在制备 非洲猪瘟病毒抗体检测试剂中的应用。 具体的，本专利技术是通过以下技术方案实现的： 1.抗原的制备和纯化：对ASFV VP73基因序列PCR扩增，并插入BamHI/XhoI酶切 位点，将扩增的片段克隆至原核表达载体PGEX-KG中，转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细 胞，挑取经PCR和测序鉴定后的阳性克隆进行诱导表达；将提取的表达产物用SDS-PAGE分 析，Western blot检测免疫原性，6Xhis标签蛋白纯化试剂盒纯化表达的VP73蛋白，BCA 法测定蛋白浓度作为抗原备用。 2.动物免疫和多克隆抗体制备：以纯化的原核表达可溶性重组VP73蛋白为免疫 抗原，其制备方法包括如下步骤： (1)选择8周龄雌性Balb/c小鼠，取30 μ g重组蛋白抗原与等体积的弗氏完全佐 剂充分乳化后第一次免疫，皮下3?4点注射； (2)在第一次免疫后的第15天和第30天，分别进行第二次、第三次免疫，均取 30 μ g重组蛋白抗原与等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化做皮下3?4点注射； (3)第三次免疫后45天，第四次加强免疫注射抗原溶液，不加佐剂； (4)加强免疫7天后，腹腔注射0. 5mL降植烷，7天后，腹腔注射I X IO5个SP2/0细 胞； (5)接种SP2本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种非洲猪瘟病毒VP73蛋白的特异性多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：a)制备VP73蛋白重组抗原：将VP73基因序列扩增至原核表达载体GEX‑KG中，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，诱导表达获得重组蛋白抗原；b)动物免疫：取步骤a)获得的重组蛋白抗原30μg与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化制成免疫原,选择8周龄雌性Balb/c小鼠，分别在第1、15、30天对小鼠进行第一、二、三次免疫；c)加强免疫：取步骤a)获得的重组蛋白抗原30μg作为免疫原，在步骤b)中第三次免疫后45天，对小鼠进行免疫；d)对步骤c)加强免疫7天后的小鼠，腹腔注射0.5ml降植烷，7天后，接种1×105个SP2/0细胞；e)步骤d)接种SP2/0细胞7～10天后采集腹水，腹水中含有所述非洲猪瘟病毒VP73蛋白的特异性多克隆抗体。
【技术特征摘要】
1. 一种非洲猪瘟病毒VP73蛋白的特异性多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤： a) 制备VP73蛋白重组抗原：将VP73基因序列扩增至原核表达载体GEX-KG中，转化大 肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，诱导表达获得重组蛋白抗原； b) 动物免疫：取步骤a)获得的重组蛋白抗原30 yg与等体积的弗氏完全佐剂充分乳 化制成免疫原，选择8周龄雌性Balb/c小鼠，分别在第1、15、30天对小鼠进行第一、二、三 次免疫； c) 加强免疫：取步骤a)获得的重组蛋白抗原30 ii...
【专利技术属性】
技术研发人员：陶虹，花群义，吕建强，曹琛福，刘建利，靳雯雯，杨俊兴，张彩虹，孙洁，唐金明，廖立珊，
申请(专利权)人：深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：广东;44
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