一种基于金纳米颗粒构建多功能基因治疗载体的方法技术

一种基于金纳米颗粒构建多功能基因治疗载体的方法。本发明专利技术属于CT造影剂及非病毒基因载体技术领域，具体涉及以金纳米颗粒为骨架，包括球形金纳米颗粒、棒状金纳米颗粒(不同轴径比)、箭头形金纳米颗粒、八面体形金纳米颗粒等形貌，利用修饰过的牛血清蛋白包裹金纳米颗粒，ATRP法构建多功能基因载体。该聚合反应平稳，易于调控，并可根据需要制备出多种不同单体含量高性能阳离子基因载体，并且其储存稳定性好，放置几天或几个月后仍可保持原有性能。该阳离子基因载体在HepG2、COS7、293、C6等细胞中具有高于国际上“金标”PEI的转染效率，并且细胞毒性远低于PEI，使用方法简单，具有商业化潜力。并且该材料具有良好的CT成像效果，为新型造影剂的开发打下了良好的实验基础。

【技术实现步骤摘要】
一种基于金纳米颗粒构建多功能基因治疗载体的方法
本专利技术属于CT造影剂及非病毒基因载体
，具体涉及以金纳米颗粒为骨架，包括球形金纳米颗粒、棒状金纳米颗粒(不同轴径比)、箭头形金纳米颗粒、八面体形金纳米颗粒等形貌，利用修饰过的牛血清蛋白包裹金纳米颗粒，ATRP法构建多功能基因治疗载体的方法。
技术介绍
基因治疗是将正常基因导入造血干细胞或其他组织细胞，通过恢复或增添基因表达，纠正其特定的遗传性缺陷、基因结构或功能上的错乱，阻止病变的进展，或抑制病毒遗传信息的复制和表达，从而达到治疗目的的方法。目前基因治疗在攻克人类癌症、遗传疾病以及心血管等重大疾病方面起到举足轻重的作用。基因治疗有三个重要的环节，目标基因的发现、基因载体的研制和目标基因在细胞内的特异性表达。其中，基因导入系统是基因治疗的核心，缺乏安全高效的基因载体是目前制约基因治疗实施的主要瓶颈。基因载体是作为基因导入细胞的工具，可以把目的基因送入靶细胞内，从而发挥目的基因的特定功能。应用于基因治疗的载体主要分为病毒载体(viralvector)和非病毒载体(non-viralvector)。病毒载体主要为逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒及单纯疱疹病毒，其优点是转染率高，缺点是缺乏安全性，可能引起致癌作用与不希望的自身免疫反应(unexpectedimmuneresponse)和白细胞的病毒变化，甚至可能造成病人多器官衰竭导致死亡。此外病毒载体还会引起插入突变的现象，可能导致宿主细胞的恶行转化，而且病毒载体携带DNA的能力有限，不利于大规模的生产。由于它的上述弱点，目前科学界已经研究重心转向非病毒技术的研究与开发。与病毒性载体相比，非病毒载体安全性高，并且具有低免疫原性、能够携带大量DNA分子、容易大批量生产及费用低廉等优点，是一个有潜力的替代路线，故人们愈来愈重视人工合成的非病毒载体的研究。阳离子聚合物是目前研究最广泛的人工合成非病毒载体。阳离子聚合物能够自发与带负电荷的基因通过电荷相互作用，可形成带正电荷纳米级的复合体(complex)，从而协助基因穿过带负电的细胞膜。此外，阳离子聚合物载体也能够保护质粒，避免被核酸酶降解，加速基因的细胞转染。CT技术因其优良的空间和密度的分辨率成为了最为广泛的分子影像学手段之一，在临床上受到广泛的使用。为了提高造影效果，目前临床上多使用基于碘的小分子造影剂。这种造影剂主要是通过吸附的细胞膜表面进行造影。所以这种造影剂存在体内的循环时间短，并且高浓度时具有肾脏毒性等缺点。因此研发新型的造影剂体系非常重要。并且目前为止，新型造影剂的开发更多侧重于无机纳米颗粒。金属纳米粒子显示出明丽的颜色，如金纳米球呈现红色，银纳米球呈现黄色。当纳米粒子的形貌或尺寸发生变化，其颜色也随之改变。颜色取决于粒子的表面等离子体共振。在光照的作用下，纳米粒子的导带电子受到激励而集体振动，产生电磁场，这种现象称为表面等离子体共振(SPR)。表面等离子体共振源于粒子中导带电子与电磁波的相互作用。在相互作用过程中，一些光子会以谐振频率朝各个方向释放出来，称之为散射。同时，一些光子将转化为声子或晶格振动，此过程谓之吸收。粒子的SPR特性取决于粒子本身的形貌、尺寸以及它们所处的环境。越来越多的人投入到纳米粒子特性的研究上来，使得纳米粒子的应用领域不断拓展。金纳米颗粒因为具有较高的X-设点吸收系数，良好的生物相容性，以及表面易修饰等独特的性质和明显的优势正受到越来越广泛的关注。在已经报道的工作中，棒状金纳米颗粒能够实现靶向运输，并在肿瘤内的积累，可以应用于药物运输以及释放导致肿瘤细胞的死亡。最近的科学发现，棒状金纳米颗粒可以用于HIV疫苗的制剂，用来治疗HIV。棒状金纳米颗粒也可用于基因传递，诱导基因沉默，开发基因治疗方法。此外由于棒状金纳米颗粒能够吸收近红外光，并能将吸收的光能转化为热能，引起温度的升高，因此可以应用于光热治疗，这种光诱导的热能也能够导致质粒DNA的可控释放，为基因重组及治疗提供了有效的工具。所以金纳米颗粒良好的标记材料和新型造影剂。但是合成金纳米颗粒过程中，会引入表面活性剂CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，CTAB有着很强的细胞毒性，所以对金纳米颗粒进项表面修饰，除去CTAB，降低毒性，是利用金纳米棒的前提。近年来，随着活性/可控自由聚合(living/controlledradicalpolymerization,LRP)研究的快速发展，LRP技术在制备具有新颖特定功能的生物高分子材料中也得到了巨大发展。LRP集活性可控聚合与自由基聚合的优点为一身，不但可得到相对分子量分布极窄、相对分子量可控、结构明晰的高分子，而且可聚合的单体多，反应条件温和易控制。所以，LRP技术具有极高的实用价值，受到了高分子化学家们的重视。其中，ATRP(原子转移自由基聚合)近几年得到了迅速发展并有着重要应用价值。其所用引发剂一般为卤代烷烃，基本原理是通过一交替的“活化-去活”可逆反应使体系中游离基浓度极低，迫使不可逆终止反应降低到最低程度，而链增长反应仍可进行，从而实现“活性”聚合。ATRP反应温度适中，适用单体范围广，甚至可以在少量氧存在下进行，对高分子材料的分子设计不需复杂的合成路线，是现有其它活性聚合方法无法比拟的，因此可以说ATRP技术的出现开辟了活性聚合的新领域。随着高分子科学、医学、生物学以及工程学等多门学科的相互交融、相互渗透和迅速发展，高分子基因载体材料进入一个快速发展的时期。目前，文献中报道一系列非病毒阳离子聚合物载体，包括聚-L-赖氨酸(poly(L-Iysine)，PLL)、聚乙二胺树枝状聚合物(poly(amidoamine)，PAMAM)、聚甲基丙烯酸N，N-二甲氛基乙酯(poly(2-dimethylaminoethylmethacrylate),PDMAEMA)、聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)等。其中PEI具有较高的转染效率，是阳离子非病毒载体中公认的“金标”。但是上述阳离子聚合物仍具有相当高的毒性，大大限制了它们的应用。这样，开发低毒而高效阳离子聚合物是研究非病毒基因载体的核心内容。最近，我们发现以多糖为骨架的聚阳离子的星状或者梳妆的基因载体，具有较高的基因转染效率和较低的细胞毒性。所以我们以金纳米颗粒(球形金纳米颗粒、棒状金纳米颗粒、箭头形金纳米颗粒、八面体形金纳米颗粒)为骨架构建低毒高效的星状阳离子基因载体，并且利用棒状金纳米颗粒作为CT成像的造影剂，达到在诊断和治疗的过程中实时成像的效果。综上所述，尽管在利用活性可控自由基聚合法制备以金纳米颗粒为骨架的多功能基因载体方面已经做了很多工作，但是在技术方面还有以下问题需要解决：1、在制备高性能金纳米颗粒基因载体时，如何尽可能的除去合成金纳米颗粒时所引入的表面活性剂CTAB，降低细胞毒性，是合成该基因载体的前提。2、如何在金纳米颗粒表面引入ATRP引发点，并且不影响金纳米颗粒的的分散状态。金纳米颗粒并不是很稳定，除去CTAB后，很容易在反应过程中团聚，如何在保证其分散性的情况下，引入ATRP引发点是ATRP反应的前提。3、在制备高性能金纳米颗粒基因载体时，随着单体不断的接枝到金纳米颗粒骨架上，阳离子基因载体的分子量随之增大，细胞内吞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于金纳米颗粒构建多功能基因治疗载体的方法，其特征在于，其具体操作步骤为：1)牛血清蛋白修饰ATRP引发点：该反应体系由有机溶剂、pH＝7.4的PBS缓冲液、1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨丙基)碳二酰亚胺、N‑羟基琥珀酰亚胺、2‑溴异丁酰溴、三乙胺和牛血清蛋白组成；反应温度为0‑80℃，优选0‑70℃；反应时间为1‑100h，优选1‑90h；最后透析冻干得产物；其中2‑溴异丁酰溴与1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨丙基)碳二酰亚胺的质量比为0.1‑50，优选0.1‑45；2‑溴异丁酰溴与N‑羟基琥珀酰亚胺的质量比为0.1‑50，优选0.1‑45；2‑溴异丁酰溴与牛血清蛋白的质量比为0.1‑100，优选0.1‑90；2‑溴异丁酰溴与有机溶剂的质量比为0.01‑10，优选0.01‑9.5；2‑溴异丁酰溴与pH＝7.4的PBS缓冲液的质量比为0.01‑10，优选0.01‑9.5；2‑溴异丁酰溴与三乙胺的质量比为0.01‑5，优选0.01‑4.5；2)制备金纳米颗粒引发剂：将1‑10mg金纳米颗粒与1‑20mg步骤1)的产物混合，用H2O稀释到1‑10mL，30‑60℃反应12‑100h，离心洗涤；3)聚合反应：该反应体系由金纳米颗粒引发剂、有机溶剂、单体、配体、CuBr、CuBr2和水组成，在无氧环境下连续进行；反应温度为0‑60℃，优选5‑55℃，更优选10‑50℃；反应时间为l‑200min，优选l‑190min；其中水与金纳米颗粒引发剂的质量比为50‑500，优选50‑490；单体与金纳米颗粒引发剂的质量比为50‑500，优选50‑490；配体与金纳米颗粒的质量比为1‑50，优选1‑15；CuBr与金纳米颗粒引发剂的质量比为0.1‑10，优选0.1‑9.5；CuBr2与金纳米颗粒引发剂的质量比为0.1‑5，优选0.1‑4.5；有机溶剂与金纳米颗粒引发剂的质量比为50‑500，优选50‑490；4)聚合反应完成后加入水或者暴露在空气中，使引发体系失活和终止聚合，水的加入量为金纳米颗粒引发剂质量的100‑500倍，然后放入截留分子量为2500‑4500MW的透析袋中，在去离子水中透析；最后将透析袋中的产物冷冻干燥直至除去所有水分即得基于金纳米颗粒构建的多功能基因治疗载体。...

【技术特征摘要】
1.一种基于球形金纳米颗粒构建多功能基因治疗载体的方法，其特征在于：1)球形金纳米颗粒合成：向圆底烧瓶中加入50mLH2O和0.5mL浓度为0.24M的HAuCl4溶液，混合均匀，放入135℃油浴中，搅拌，待其沸腾，加入450μL质量分数为1％的柠檬酸钠，继续搅拌2min；取出，放入27℃水浴冷却，加入1.82g十六烷基三甲基溴化铵，搅拌12h；7000rpm离心得到沉淀；2)牛血清蛋白修饰ATRP引发点：先将0.1g2-溴异丁酰溴加入2mLDMF中，然后加入0.2885g1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二酰亚胺、0.15gN-羟基琥珀酰亚胺、500μL三乙胺；最后加入5mLpH＝7.4的PBS缓冲液和0.2g牛血清蛋白；37℃搅拌反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐福建，赵娜娜，闫彭，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：北京;11