一种高效筛选能充分利用瓜氨酸的乳酸菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种高效筛选能充分利用瓜氨酸的乳酸菌的方法，属于微生物领域。本发明专利技术方法为从基因型着手筛选多拷贝基因的细菌，考察其代谢瓜氨酸的能力，从而筛选到能高效利用瓜氨酸的乳酸菌，通过共培养降低瓜氨酸的含量。

【技术实现步骤摘要】
一种高效筛选能充分利用瓜氨酸的乳酸菌的方法
本专利技术涉及一种高效筛选能充分利用瓜氨酸的乳酸菌的方法，属于微生物领域。
技术介绍
氨基甲酸乙酯(Ethylcarbamate,EC)是一种致癌物质，被人体过量持续摄入可能会引发肺癌、肝癌等严重性肿瘤疾病，并且对人体的免疫系统造成伤害。氨基甲酸乙酯广泛存在于各种酒类饮料和发酵食品中，酱油属于发酵食品，在其中检测出了氨基甲酸乙酯。酿造酱油中氨基甲酸乙酯的主要形成途径是瓜氨酸与乙醇反应生成，而酱醪中的乳酸菌是通过精氨酸脱亚氨基途径(ADI途径)消耗精氨酸，产生瓜氨酸。ADI途径(图1)由ADI(arcA编码)，OTC(arcB编码)，CK(arcC编码)三个酶催化的反应组成。其中ADI酶催化精氨酸转化为瓜氨酸，OTC酶催化瓜氨酸转化为鸟氨酸，CK酶降解鸟氨酸产生ATP、CO2和NH3。筛选能够充分利用瓜氨酸的微生物，以用于降低酱油中瓜氨酸的含量，是减少和控制酱油中氨基甲酸乙酯的有效措施之一。酱油中的常见的微生物如乳酸菌(魏斯氏菌、乳酸足球菌以及嗜盐四联球菌等)和葡萄球菌，芽孢菌等都存在ADI途径，可以利用精氨酸，在特定条件下积累瓜氨酸。目前，尚未有关于有效筛选降解瓜氨酸的微生物的应用实例。本专利技术旨在提供一种能够高效筛选能利用瓜氨酸的微生物的方法，以ADI途径七个基因为筛子，并通过精氨酸、瓜氨酸代谢能力分析验证了所筛选得到的微生物降解瓜氨酸的能力。
技术实现思路
本专利技术提供了一种高效筛选能利用瓜氨酸的微生物的方法。所述方法主要包括以下步骤：(1)分离样品中的细菌并提取各细菌基因组；(2)以基因组为模版，设计引物PCR验证所筛选细菌基因组中是否含有arcA、arcB、arcC、arcB1、arcC1、arcB2、arcC2这7个基因，挑选基因组中有这7个基因的细菌，进入下一步筛选；(3)以含有精氨酸或瓜氨酸的氨基酸检测培养基培养所得微生物，检测精氨酸和瓜氨酸的分解、积累情况，筛选能利用精氨酸和瓜氨酸且不积累瓜氨酸的微生物。所述arcA、arcB、arcC、arcB1、arcC1、arcB2、arcC2基因的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1-7所示。所述步骤(2)采用的引物如表1所示。所述氨基酸检测培养基含有(g/L)：酵母膏5.0，牛肉膏5.0，胰蛋白胨5.0，NaCl180.0，葡萄糖0.5，Tween-801.0，MgSO4·7H2O0.2，MnSO4·H2O0.05，FeSO40.4，柠檬酸三胺2.0，CaCO30.1，吡哆醛-5-磷酸0.05，K2HPO42.0，pH6.0，氨基酸5.0。在本专利技术的一种实施方式中，所述细菌为乳酸菌。在本专利技术的一种实施方式中，筛选得到符合条件的嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)BBER23，于2013年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M2013480。所得嗜盐四联球菌在添加了精氨酸的正常培养条件下，不积累瓜氨酸；在高盐胁迫的培养条件下该菌仍具有快速降解精氨酸的能力，同时不积累瓜氨酸；在高盐胁迫的培养条件下该菌能彻底消耗培养基中含有的3g/L瓜氨酸；当其与积累瓜氨酸的乳酸足球菌共培养时，可以显著降低培养液中由乳酸足球菌产生的瓜氨酸。本专利技术提供了一种高效筛选能充分利用瓜氨酸的乳酸菌的方法。该方法为从基因型着手筛选多拷贝基因的细菌，考察其代谢瓜氨酸的能力，从而筛选到能高效利用瓜氨酸的乳酸菌，通过与产瓜氨酸的微生物进行共培养，可以降低瓜氨酸的含量。附图说明图1ADI途径图2A:37℃下共培养对乳酸足球菌ADI途径的影响；对照组：不添加T.halophilus，实验组为添加T.Halophilus；其中精氨酸的变化量为精氨酸的消耗量，瓜氨酸和鸟氨酸的变化量为两种氨基酸的生成量；B:16℃下共培养对乳酸足球菌ADI途径的影响；对照组：不添加T.halophilus，实验组为添加T.Halophilus；其中精氨酸的变化量为精氨酸的消耗量，瓜氨酸和鸟氨酸的变化量为两种氨基酸的生成量；C:共培养对乳酸足球菌瓜氨酸积累效率的影响；对照组：不添加T.halophilus，实验组为添加T.Halophilus；瓜氨酸的积累效率为每摩尔精氨酸转化生成的瓜氨酸的摩尔数。图3嗜盐四联球菌R23和C3ADI途径基因簇解析及验证。具体实施方式嗜盐四联球菌分离平板：100g/LNaCl，溴甲酚紫0.06g/L，50μ/ml制霉菌素，100g/L生酱油，琼脂20g/L)。培养条件：30℃，5-7天。可培养乳酸菌分离平板：MRS培养基，2g/L琼脂，购于OXIOD公司可培养细菌分离平板：营养肉汤培养基：10g/L蛋白胨，5g/L牛肉膏，10g/LNaClMRS培养基为培养乳酸杆菌专用。嗜盐四联球菌分离培养基：改良MRS：100g/LNaCl，溴甲酚紫0.06g/L，50μ/ml制霉菌素，100g/L生酱油)，30℃，5-7天。氨基酸检测培养基(g/L)：酵母膏5.0，牛肉膏5.0，胰蛋白胨5.0，NaCl180.0，葡萄糖0.5，Tween-801.0，MgSO4·7H2O0.2，MnSO4·H2O0.05，FeSO40.4，柠檬酸三胺2.0，CaCO30.1，吡哆醛-5-磷酸0.05，K2HPO42.0，pH6.0，氨基酸5.0。嗜盐四联球菌的培养条件为：将保藏的嗜盐四联球菌在含100g/LNaCl的MRS固体培养基上划线，于30℃静置培养4天，挑取单菌落接入含10％NaCl的MRS液体培养基，30℃静置培养四天，离心10min(6000rpm，4℃)后收集菌体，用磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.0)悬浮菌体。实施例1酱油中可培养微生物分离从酿造酱油的成曲中取样稀释分别涂布到MRS和营养肉汤培养基平板上，37℃富集培养5天。挑选不同菌落形态的单菌落接种到含有MRS和营养肉汤培养基平板上，划线分离作纯培养。四天后，将纯培养物接种到MRS和营养肉汤液体培养基中培养四天富集菌体，提取基因组。以细菌16SrDNA的PCR通用引物PCR获得16SrDNA，通过16SrDNA测序结果与数据库比对，确定分离的培养物有魏斯氏菌、葡萄球菌、乳酸足球菌、嗜盐四联球菌。PediococcusacidilacticiBBE1120保藏编号为CCTCCNO:M2013732。TetragenococcushalophilusBBER23于2013年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M2013480。TetragenococcushalophilusBBEC3于2013年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M2013479。实施例2ADI途径基因分析根据NCBIGenBank中公布的关于魏斯氏菌、葡萄球菌、乳酸足球菌的数据：魏斯氏菌(WeissellaconfusaLBAEC39-2)GenBankAssemblyID:GCA_000239955.2，魏斯氏菌(WeissellacibariaKACC11862)GenBankAssemblyID:G本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效筛选能利用瓜氨酸的微生物的方法，所述方法主要包括以下步骤：(1)分离样品中的细菌，并提取分离得到的细菌的基因组；(2)以基因组为模版，设计引物PCR验证所筛选细菌基因组中是否含有arcA、arcB、arcC、arcB1、arcC1、arcB2、arcC2这7个基因，挑选基因组中有这7个基因的细菌，进入下一步筛选；(3)以含有精氨酸或瓜氨酸的氨基酸检测培养基培养所得微生物，检测精氨酸和瓜氨酸的分解、积累情况，筛选能利用精氨酸和瓜氨酸且不积累瓜氨酸的微生物。

【技术特征摘要】
1.一种高效筛选能利用瓜氨酸的微生物的方法，所述方法主要包括以下步骤：(1)分离样品中的细菌，并提取分离得到的细菌的基因组；(2)以基因组为模版，设计引物PCR验证所筛选细菌基因组中是否含有arcA、arcB、arcC、arcB1、arcC1、arcB2、arcC2这7个基因，挑选基因组中有这7个基因的细菌，进入下一步筛选；(3)以含有精氨酸或瓜氨酸的氨基酸检测培养基培养所得微生物，检测精氨酸和瓜氨酸的分解、积累情况，筛选能利用精氨酸和瓜氨酸且不积累瓜氨酸的微生物；所述arcA、arcB、arcC、arcB1、arcC1、arcB2、arcC2基因的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1-7所示；所述氨基酸检测培养基按g/L计含有：酵母膏5.0，牛肉膏5.0，胰...

【专利技术属性】
技术研发人员：方芳，陈坚，廖淡宜，杨怡敏，堵国成，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32