本发明专利技术提供了一种简单、快速提取和纯化Taq-DNA聚合酶的方法。该方法充分利用了乙醇对蛋白质的沉淀作用和核酸酶活性，简化了Taq-DNA聚合酶提取和纯化的步骤，缩短了操作时间和节约了成本。与已知的提取方法相比，我们的方法具有简单、快速和成本低的特点，完全去除了Taq-DNA聚合酶提取产物中的核酸污染。提取的Taq-DNA聚合酶可以应用于各种PCR反应中，包括实时定量PCR反应。
【技术实现步骤摘要】
一种简单、快速提取和纯化Taq-DNA聚合酶的方法
本专利技术属于生物化学及分子生物学领域，涉及一种简单、快速提取和纯化Taq-DNA聚合酶的方法，适合用于大量低成本商业生产制备Taq-DNA聚合酶。
技术介绍
PCR技术广泛应用于生物学、农学和医学的实验中，而其中分离自耐热菌Thermusaquaticus的DNA聚合酶（Taq）是PCR技术的关键因子。编码该酶的基因已经转入大肠杆菌中高效表达，极大的提高了该酶的产量，大大降低了PCR技术的成本。Taq-DNA聚合酶全酶由832个氨基酸组成，大小94kD；去除该酶的5’到3’外切酶活性，大小变为61kD，称之为Stoffel片段。Lawyer等首次将Taq-DNA聚合酶基因在大肠杆菌中表达，并利用该酶的热稳定性分离Taq-DNA聚合酶。75℃加热1小时，可以去除大部分杂蛋白。Engelke等（1990）进一步采用聚乙烯亚胺（polyethyleneimine）和BioRex70纯化，他们的结果在SDS电泳中表现出一条Taq-DNA聚合酶的主带和几条杂蛋白的弱带。然而，采用这种分离方法，从裂解细菌开始至少需要忙碌一天，才能完成。1993年，Lawyer等发展了另一套分离纯化方法，他们的方法采用Polyethyleneimine和硫酸铵纯化，Phenyl-SepharoseCL-4B去除核酸。和Engelke方法比较，变得更复杂但去除了核酸的污染。实际上，提取液中的杂蛋白并不影响Taq-DNA聚合酶的酶活，但DNA的污染，可能会影响PCR反应，一些短的DNA片段可能会作为引物产生假阳性条带，特别是以大肠杆菌作为底物时进行PCR反应时。Pluthero（1993）简化了Engelke方法，采用硫酸铵沉淀，透析去除终产物中的硫酸根和铵根离子。目前，多数实验室自制Taq-DNA聚合酶采用这一方法，但我们发现，这一方法制作的Taq-DNA聚合酶混有少量的DNA，硫酸铵沉淀造成Taq-DNA聚合酶的较大损失，透析需要花费较多的时间。2012年，钟星等利用转基因大肠杆菌，经过简单加热，离心，直接提取分泌到培养基中的Taq-DNA聚合酶，但他们没有提供酶浓缩和纯化的方法。酶中的培养基残液未能去除。和全酶相比，Stoffel片段表现出更强的热稳定性，这一性质被应用于对该酶的分离。采用沸水浴裂解细菌，离心去除变性杂蛋白，而后采用磷酸氢二钠和乙醇去除DNA，从而快速分离纯化Stoffel片段。我们曾试图采用这一方法分离Taq全酶，但遗憾的是，沸水浴并不能有效地裂解大肠杆菌，分离产物不能长期储存，-20℃放置两天，就可引起酶的失活。这些结果说明这一方法并不适用于Taq全酶的分离纯化，但我们偶然发现，乙醇可以有效的沉淀Taq-DNA聚合酶并保持其活性。因而，我们利用这一性质，改进Pluthero的提取方法，缩短了提取时间，简化了提取方法，提高了Taq-DNA聚合酶的质量和产量。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种简单、快速提取和纯化Taq-DNA聚合酶的方法，该方法充分利用了乙醇对蛋白质的沉淀作用和核酸酶活性，简化了Taq-DNA聚合酶提取和纯化的步骤，缩短了操作时间和节约了成本。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种简单、快速提取和纯化Taq-DNA聚合酶的方法，所述方法包括以下步骤：（1）接种：挑取含Taq-DNA聚合酶E.coli单克隆，接种到3ml的含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，置于摇床，37℃，270r/min，培养5-8小时；（2）扩大培养：将步骤（1）中培养好细菌液转接到500ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，置于摇床，37℃，270r/min培养5-6小时至细菌OD600值达到0.6-0.8；（3）诱导Taq-DNA酶表达：加入异丙基硫代半乳糖苷诱导剂，置于摇床，37℃,270r/min，培养12小时；（4）收集菌体：将步骤（3）培养得到的菌液分装于50ml离心管，8000rpm离心10min，弃上清，加入25mlBufferA重悬菌液，8000rpm离心10min，弃上清；（5）裂解菌体：加入25mlBufferA重悬菌液，采用液氮和75oC水浴中交替冻融两次，加入100mg溶菌酶，室温下放置10~20分钟，直至溶液变得粘稠，而后在溶液中加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟至1mM；（6）粗提：加入25mlBufferB，75℃水浴加热30min后8000rpm离心15min，取上清；（7）纯化：在上清液中先后加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟，MgCl2，DNaseI以及RNaseA处理5min，75℃水浴加热30min，8000rpm4℃离心10mim，取上清，加入冰浴后的乙醇，终浓度为15%-99%，颠倒混匀，16000g4℃离心15min，弃上清，沉淀溶于12.5mLStoragebuffer，-20℃储存备用。所述的乙醇浓度为55%最佳。所述LB液体培养基中含有氨苄青霉素终浓度50ug/ml。步骤（3）中异丙基硫代半乳糖苷诱导剂终浓度0.5mM。步骤（5）中溶菌酶含量为4mg/ml。所述纯化步骤中蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟终浓度为1mM，MgCl2终浓度0.5mM，DNaseI浓度为5ug/ml，以及RNaseA浓度为100ug/ml。实验过程中使用的主要试剂配方：BufferA：50mMTris-HClpH=7.9，50mM葡萄糖和1mMEDTApH=8.0；BufferB：50mMTris-HClpH=7.9，50mMKCl，1mMEDTApH=8.0，0.5%Tween20和0.5%NP-40%；Storagebuffer：25mMTris-HClpH=7.9，25mMKCl，0.1mMEDTApH=8.0，50%甘油，0.5mMPMSF，1mMDTT；其它试剂依照说明书使用。本专利技术的优点在于：本专利技术提供了一种新的Taq-DNA聚合酶提取和纯化的方法。该方法充分利用了乙醇对蛋白质的沉淀作用和核酸酶活性，简化了Taq-DNA聚合酶提取和纯化的步骤，缩短了操作时间和节约了成本。与已知的提取方法相比，我们的方法具有简单、快速和成本低的特点，完全去除了Taq-DNA聚合酶提取产物中的核酸污染。提取的Taq-DNA聚合酶可以应用于各种PCR反应中，包括实时定量PCR反应。附图说明图1：DNaseI和RNaseA酶处理前后，粗酶和乙醇沉淀后的酶液中DNA和RNA的含量。取10μL样液，琼脂糖凝胶电泳。如图所示，经DNaseI和RNaseA处理后，酶液中DNA和RNA完全消失。图2：电泳检测硫酸铵法[PlutheroFG（1993）的方法]和乙醇沉淀法所提酶液中DNA与RNA的污染。取10μL酶液，琼脂糖凝胶电泳。如图所示，使用硫酸铵法所提取的酶液，经透析后还残留有少量的DNA，而使用本专利技术方法所制的酶液中无DNA残留。图3：琼脂糖凝胶电泳检测不同浓度乙醇沉淀的Taq-DNA聚合酶活性。经40%、45%、50%、55%、66.7%（2倍体积的乙醇）和70%的乙醇纯化后，PCR反应测定后，琼脂糖电泳检测酶液的活力。M：标准长度的DNA；ck：表示商用酶，购置于上海生工生物工程有限公司；其中酶的量是稀释20倍以后所加入的量。所扩增的基因为水稻actin基因本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种简单、快速提取和纯化Taq‑DNA聚合酶的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：（1）接种：挑取含Taq‑DNA聚合酶E.coli 单克隆，接种到3ml的含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，置于摇床，37℃，270 r/min，培养5‑8 小时；（2）扩大培养：将步骤（1）中培养好细菌液转接到500 ml 含氨苄青霉素的LB液体培养基中，置于摇床，37℃，270 r/min培养5‑6小时至细菌OD600 值达到0.6‑0.8；（3）诱导Taq‑DNA酶表达：加入异丙基硫代半乳糖苷诱导剂，置于摇床，37℃, 270 r/min，培养12小时；（4）收集菌体：将步骤（3）培养得到的菌液分装于50 ml离心管，8000 rpm 离心10min，弃上清，加入25ml Buffer A重悬菌液，8000 rpm 离心10min，弃上清；（5）裂解菌体：加入25 ml Buffer A重悬菌液，采用液氮和75 oC水浴中交替冻融两次，加入100mg溶菌酶，室温下放置10~20分钟，直至溶液变得粘稠，而后在溶液中加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟至1mM；（6）粗提：加入25 ml Buffer B，75℃水浴加热30 min后8000 rpm 离心15min，取上清；（7）纯化：在上清液中先后加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟，MgCl2，DNase I以及RNase A处理5 min，75℃水浴加热30 min，8000 rpm 4℃ 离心10 mim，取上清，加入冰浴后的乙醇，终浓度为15%‑99%，颠倒混匀，16000 g 4℃离心15 min，弃上清，沉淀溶于12.5mL Storage buffer，‑20℃储存备用。...
【技术特征摘要】
1.一种简单、快速提取和纯化Taq-DNA聚合酶的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：（1）接种：挑取含Taq-DNA聚合酶的E.coli单克隆，接种到3ml的含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，置于摇床，37℃，270r/min，培养5-8小时；（2）扩大培养：将步骤（1）中培养好细菌液转接到500ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，置于摇床，37℃，270r/min培养5-6小时至细菌OD600值达到0.6-0.8；（3）诱导Taq-DNA酶表达：加入异丙基硫代半乳糖苷诱导剂，置于摇床，37℃,270r/min，培养12小时；（4）收集菌体：将步骤（3）培养得到的菌液分装于50ml离心管，8000rpm离心10min，弃上清，加入25mlBufferA重悬菌液，8000rpm离心10min，弃上清；（5）裂解菌体：加入25mlBufferA重悬菌液，采用液氮和75℃水浴中交替冻融两次，加入100mg溶菌酶，室温下放置10~20分钟，直至溶液变得粘稠，而后在溶液中加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟至1mM；（6）粗提：加入25mlBufferB，75℃水浴加热30min后8000rpm离心15min，取上清；（7）纯化：在上清液中先后加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟，MgCl2，DNaseI以及RNaseA处理...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙新立，陈思雀，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
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