本发明专利技术公开了一种获得斗鸡特异性分子标记的方法，通过目标区域捕获测序筛查不同鸡种的16号染色体，利用MEGA软件进行序列比对，根据比对结果利用Oligo等软件设计引物，对不同鸡种进行PCR扩增并进行测序验证。根据测序结果发现，斗鸡与其他鸡种在一段序列上存在特异性差异，差异在于这段序列上固始鸡存在特异性的18个bp的缺失(CATTCCCGTTCCCGTTCG)，其他鸡种无此特点，通过琼脂糖凝胶电泳也可清晰的鉴别出来。因此，这段序列可以作为一种鉴定斗鸡特异性的分子标记。应用这种分子标记鉴定鸡种，操作相对简单，特异性高而且重复性高，也为家禽品种资源的正确保存和合理利用增添了新的科学依据。
【技术实现步骤摘要】
： 本专利技术涉及动物育种学、分子遗传学和分子生物学领域。 技术背景： 斗鸡是世界各地几乎都有的娱乐传统，利用鸡形目的鸟（也有其他目的）在发情 期好斗的特点来进行比赛。斗鸡是供竞赛和娱乐用的鸡品种，以善打善斗而著称的珍禽，又 名打鸡、咬鸡、军鸡。斗鸡中的河南斗鸡是中国古老鸡种之一。在中国斗鸡品种中体型最大， 数量最多，其胸、腿肌发达，可作为肉鸡育种的原始素材，主产于河南省开封、郑州、洛阳、周 口等市。河南斗鸡体质类型有4种，粗糙疏松型、细致型、紧凑型和细致紧凑型。 长期以来，主要是以常规形态学标记分析手段进行动物品种分类和真伪鉴定。形 态学标记分析简便、经济，但由于形态学特征常常受环境因素的影响，具有表型可塑性和遗 传可变性，容易导致不正确的分类与鉴定；并且形态学方法无法鉴定许多群体中普遍存在 的隐存分类单元，应用分子生物学技术将有利于品种鉴定。形态学鉴定的局限性和不断缩 减的分类学家队伍，使分类学的发展面临巨大的挑战。 本专利技术利用高通量测序手段对不同鸡种进行测序,通过对不同鸡种间的DNA序列 进行筛查比对，找到在不同鸡种间出现的特异性序列，并对这段序列设计引物进行PCR扩 增和重测序验证，以期通过分子生物学技术手段，找到一种分子标记，可以对不同鸡种进行 更精确的分类。
技术实现思路
： 本专利技术的目的是获得斗鸡特异性的分子标记。 本专利技术的技术方案是： -种获得斗鸡特异性分子标记的方法，其特征在于：通过目标区域捕获测序筛查 27种鸡种的16号染色体，并利用MEGA软件进行序列比对，根据比对结果利用Oligo软件设 计引物，对不同鸡种进行PCR扩增并进行测序验证，根据分析结果即可得到斗鸡特异性的 分子标记，即CATTCCCGTTCCCGTTCG，具体步骤如下： 材料与方法 1. 1实验材料 选取罗斯鸡、黑狼山鸡、斗鸡、如草鸡、固始鸡、藏鸡、乌骨鸡、雪山草鸡、红色原鸡、 萧山鸡、隐性白羽肉鸡、茶花鸡、鹿苑鸡、安卡鸡、油鸡、大骨鸡、文昌鸡、青脚麻鸡、太湖鸡、 溧阳鸡、绿壳蛋鸡、AA鸡、广西黄鸡、来航鸡、仙居鸡、白耳鸡、广西黄鸡27种不同鸡种； 1.2目标区域捕获测序 对每个鸡品种采集10个样本，翅静脉采血0. 4ml，加入0. 5mol/LNa2EDTA抗凝剂 2 μ L，加入裂解液4ml后于4°C保存备用；利用苯酚抽提法提取DNA，送入华大基因公司进行 目标捕获测序，选取Gallus_gallus-4. 0作为参考基因组； 1.3序列比对 目标区域捕获测序得到不同鸡种在16号染色体上的全序列，利用软件MEGA5. 1对 不同鸡种间进行序列比对，发现不同鸡种在序列上的差异情况； 1.4引物设计 根据序列比对结果，选取不同鸡种间出现特异性差异的一段序列，利用不同 鸡种DNA作为模板，并利用Oligo软件设计引物进行PCR扩增，引物名称为：D0UJI ; 座位：chromosomel6 ;5 ' -3 '的引物序列为：F:CCGCGCTGACCTCGTCTCGCTGTGT， R:CTCGGCGGGGCAGCAGCTAATTCAG ;退火温度：66. 3°C ; 1.5PCR扩增和检测 PCR扩增总体积为20μ LdyLDNA模板，其浓度为IOOng/μ L， 24 1^0父？0?1^€61'，1.54 1^阶13，浓度为1〇111111〇1/1，上下游引物各14 1^浓度为1(^111〇1/ μ L，Taq 酶为 0· 2 μ L，浓度为 5U/ μ L，ddH2013. 3 μ L ;PCR 扩增程序：95°C预变性 5min，94°C 变性40s，适宜退火温度40s，72°C延伸40s，35个循环，最后72°C延伸lOmin，4°C保存备用； 把PCR产物进行测序并用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测，电压为100V，电泳40min ; 结果 通过目标区域捕获测序，发现了斗鸡与其他鸡种存在差异的一段序列，设计引 物PCR扩增进行重测序并用琼脂糖凝胶电泳进行验证，发现斗鸡与其他鸡种在这段序 列上存在特异性差异，差异在于：在这段序列上斗鸡存在特异性的18个bp的缺失，即 CATTCCCGTTCCCGTTCG。 本专利技术的有点是应用这种分子标记鉴定鸡种，操作相对简单，特异性高而且重复 性高，也为家禽品种资源的正确保存和合理利用增添了新的科学依据。 【附图说明】 附图1为斗鸡与其他鸡种序列示意图； 附图2为斗鸡与其他鸡种琼脂糖凝胶电泳图。 【具体实施方式】 下面结合附图对本专利技术作进一步详细描述： 实施例 本专利技术的技术方案是：通过目标区域捕获测序筛查不同鸡种的16号染色体，并利 用MEGA软件进行序列比对，根据比对结果利用01 igo等软件设计引物，对不同鸡种进行PCR 扩增并进行测序，根据分析结果可以得到鉴定斗鸡特异性的分子标记。所采用的材料与方 法以及所获得的结果如下所示： 1材料与方法 I. 1实验材料 选取罗斯鸡、黑狼山鸡、斗鸡、如草鸡、固始鸡、藏鸡、乌骨鸡、雪山草鸡、红色原鸡、 萧山鸡、隐性白羽肉鸡、茶花鸡、鹿苑鸡、安卡鸡、油鸡、大骨鸡、文昌鸡、青脚麻鸡、太湖鸡、 溧阳鸡、绿壳蛋鸡、AA鸡、广西黄鸡、来航鸡、仙居鸡、白耳鸡、广西黄鸡27种不同鸡种，其中 仙居鸡、茶花鸡、鹿苑鸡、白耳鸡、藏鸡、固始鸡、大骨鸡、河南斗鸡、狼山鸡、泰和乌骨鸡、萧 山鸡、北京油鸡12个地方鸡品种均来自中国农业科学研究院家禽科学研究所国家地方禽 种资源基因库，红色原鸡采自云南省野生动物救护中心；另外14个鸡品种来自扬州大学动 物科学与技术学院遗传资源实验室禽种资源基因库； 1.2目标捕获测序 对每个鸡品种采集10个样本，翅静脉采血0. 4ml，加入0. 5mol/LNa2EDTA抗凝剂 2 μ L，加入裂解液4ml后于4°C保存备用；利用苯酚抽提法提取DNA，送入华大基因公司进行 目标捕获测序，选取Gallus_gallus-4. 0作为参考基因组。 1.3序列比对 目标捕获测序得到不同鸡种在16号染色体上的全序列，利用软件MEGA5. 1对不 同鸡种间进行序列比对，发现不同鸡种在序列上的差异情况。 1.4引物设计 根据序列比对结果，选取不同鸡种间出现特异性差异的一段序列。利用不同鸡种 DNA作为模板，利用Oligo等软件设计引物进行PCR扩增，引物序列为： 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种获得斗鸡特异性分子标记的方法，其特征在于：通过目标区域捕获测序筛查27种鸡种的16号染色体，并利用MEGA软件进行序列比对，根据比对结果利用Oligo软件设计引物，对不同鸡种进行PCR扩增并进行测序验证，根据分析结果即可得到斗鸡特异性的分子标记，即CATTCCCGTTCCCGTTCG，具体步骤如下：材料与方法1.1实验材料选取罗斯鸡、黑狼山鸡、斗鸡、如草鸡、固始鸡、藏鸡、乌骨鸡、雪山草鸡、红色原鸡、萧山鸡、隐性白羽肉鸡、茶花鸡、鹿苑鸡、安卡鸡、油鸡、大骨鸡、文昌鸡、青脚麻鸡、太湖鸡、溧阳鸡、绿壳蛋鸡、AA鸡、广西黄鸡、来航鸡、仙居鸡、白耳鸡、广西黄鸡27种不同鸡种；1.2目标区域捕获测序对每个鸡品种采集10个样本，翅静脉采血0.4ml，加入0.5mol/LNa2EDTA抗凝剂2μL，加入裂解液4ml后于4℃保存备用；利用苯酚抽提法提取DNA，送入华大基因公司进行目标捕获测序，选取Gallus_gallus‑4.0作为参考基因组；1.3序列比对目标区域捕获测序得到不同鸡种在16号染色体上的全序列，利用软件MEGA5.1对不同鸡种间进行序列比对，发现不同鸡种在序列上的差异情况；1.4引物设计根据序列比对结果，选取不同鸡种间出现特异性差异的一段序列，利用不同鸡种DNA作为模板，并利用Oligo软件设计引物进行PCR扩增，引物名称为：DOUJI；座位：chromosome16；5′‑3′的引物序列为：F:CCGCGCTGACCTCGTCTCGCTGTGT，R:CTCGGCGGGGCAGCAGCTAATTCAG；退火温度：66.3℃；1.5PCR扩增和检测PCR扩增总体积为20μL：1μLDNA模板，其浓度为100ng/μL，2μL10×PCRBuffer，1.5μLdNTP，浓度为10mmol/L，上下游引物各1μL，浓度为10pmol/μL，Taq酶为0.2μL，浓度为5U/μL，ddH2O13.3μL；PCR扩增程序：95℃预变性5min，94℃变性40s，适宜退火温度40s，72℃延伸40s，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存备用；把PCR产物进行测序并用2％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测，电压为100V，电泳40min；结果通过目标区域捕获测序，发现了斗鸡与其他鸡种存在差异的一段序列，设计引物PCR扩增进行重测序并用琼脂糖凝胶电泳进行验证，发现斗鸡与其他鸡种在这段序列上存在特异性差异，差异在于：在这段序列上斗鸡存在特异性的18个bp的缺失，即CATTCCCGTTCCCGTTCG。...
【技术特征摘要】
1. 一种获得斗鸡特异性分子标记的方法，其特征在于：通过目标区域捕获测序筛查27 种鸡种的16号染色体，并利用MEGA软件进行序列比对，根据比对结果利用Oligo软件设计 引物，对不同鸡种进行PCR扩增并进行测序验证，根据分析结果即可得到斗鸡特异性的分 子标记，即CAITCCCGITCCCGITCG，具体步骤如下： 材料与方法 I. 1实验材料 选取罗斯鸡、黑狼山鸡、斗鸡、如草鸡、固始鸡、藏鸡、乌骨鸡、雪山草鸡、红色原鸡、萧山 鸡、隐性白羽肉鸡、茶花鸡、鹿苑鸡、安卡鸡、油鸡、大骨鸡、文昌鸡、青脚麻鸡、太湖鸡、溧阳 鸡、绿壳蛋鸡、AA鸡、广西黄鸡、来航鸡、仙居鸡、白耳鸡、广西黄鸡27种不同鸡种； 1.2目标区域捕获测序 对每个鸡品种采集10个样本，翅静脉采血0. 4ml，加入0. 5mol/LNa2EDTA抗凝剂2 ii L， 加入裂解液4ml后于4°C保存备用；利用苯酚抽提法提取DNA，送入华大基因公司进行目标 捕获测序，选取Gallus_gallus_4. 0作为参考基因组； 1.3序列比对 目标区域捕获测序得到不同鸡种在16号染色体上的全序列，利用软件MEGA5. 1对不同 鸡种间进行序列比对，发现不同鸡种在序列上的差异情况； 1.4引物设计 根据序列比对结果，选取不同鸡种间出现特异性差异的一段序列，利用不同鸡 种DNA作为模板，...
【专利技术属性】
技术研发人员：常国斌，王洪志，廖和荣，马腾，徐琪，徐璐，张扬，万方，李志腾，郭晓敏，孙杰，陈国宏，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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