一种树枝状基因药物载体及制备和应用制造技术

本发明专利技术提供一类可生物降解的高效低毒性的树枝状聚阳离子材料，本发明专利技术利用二硫键将毒性很低的低代数树枝状阳离子聚合物链接在生物相容性很好的水溶性内核上，形成了一个高分子量的聚合物，不仅有很好的基因和药物递送效率，而且可以在细胞内降解，有效缓解了树枝状阳离子聚合物递送效率与毒性之间的矛盾。本发明专利技术选取了简单易得的多分支水溶性聚合物和低代数的树枝状阳离子聚合物作为原料，成本比较低廉；而且合成方法简易，大多是常温反应，不需要无水无氧等苛刻的反应条件，后处理一般采用萃取或透析的分离方法，操作简单。本发明专利技术结构式：

【技术实现步骤摘要】
一种树枝状基因药物载体及制备和应用
本专利技术属于生物
，涉及一类高效低毒性的可生物降解的树枝状基因药物载体，具体涉及一类树枝状聚阳离子材料及其制备方法和应用。
技术介绍
基因药物疗法是近二十年来兴起的治疗癌症的方法，其基本策略是将外源基因或抗癌药物通过载体运输的方式导入目的细胞并发挥其作用，从而达到治疗癌症的目的。基因药物疗法中，基因和药物的运输是十分重要的部分，对于运输的载体来说，将一定量的目的基因和药物高效得运输到靶细胞中，使其安全、有效、稳定得发挥作用是最基本的要求。目前应用于基因药物疗法的载体主要分成两大类:病毒性载体和非病毒性载体。病毒性载体因其天然的嗜性，能够自然感染细胞，所以具有很高的运输效率，目前基因疗法中有很多常用的病毒载体，并已进入临床试验阶段。现使用的病毒有逆转录病毒、腺病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒、腺相关病毒等。近年来在病毒载体方面的研究取得了重大进展，但由于病毒性载体仍然存在着生物安全性不足、靶向特异性不够、对某些细胞转导不完全和易诱导宿主免疫反应等缺陷，限制了病毒性载体进一步的发展（ThomasC.E.,EhrhardtA.,KayM.A.NatRevGenet.2003,4:346-358）。非病毒基因载体在基因和药物的递送效率上没有病毒性载体高，但它们具有独特的优势，如低毒性、低免疫原性、无传染、合成制备简便、结构灵活可控等（AL-DosariM.S.,GAOX.AapsJ,2009,11(4):671-681），因此得到了研究者的广泛应用，而其中的聚阳离子材料是最主要且研究最广泛的非病毒性载体之一。聚阳离子材料由于结构中带有正电荷，很容易通过静电作用与带有负电荷的核酸(DNA，RNA，PNA)形成复合物，使核酸被压缩，从而避免了被酶降解。由于复合物在通常情况下带有正的净电荷，有助于附着在细胞表面和随后的内吞及溶酶体逃逸的过程。本课题组曾发表过关于聚阳离子材料的专题论述（TANGG.P.,LUX.JournalofZhejiangUniversity:MedicalSciences.2009,38(1):1-6），近年来对聚阳离子材料的研究又有了许多突破性进展。目前常用的聚阳离子材料包括壳聚糖(chitosan)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚赖氨酸(PLL)、树枝状聚合物(dendrimer)等（MorilleM.,PassiraniC.,VonarbourgA.,etal.Biomaterials,2008,29(24-25):3477-3496）。树枝状聚合物作为一种特殊的聚合物，它拥有精确排布的分支结构，表面存在着大量的阳离子集团，可以用于基因的运输，同时由于它内部对称排列的分支单元，使整个分子呈现一种严格的三维立体结构，这就形成了很多超分子空腔，用于携带药物（MenjogeA.R.,KannanR.M.,TomaliaD.A.DrugDiscov.Today.2010,15:171–185）。但是树枝状聚合物在运输效率和自身毒性上存在着一定的矛盾，高代数的树枝状分子具有很好的运输效率，但是由于降解性差而表现明显的细胞毒性。同时高代数树枝状分子的合成方面也十分困难（ChengY.Y.,ZhaoL.B.,LiY.W.,XuT.W.Chem.Soc.Rev.2011,40:2673−2703；Kukowska-latalloJ.F.,BielinskaA.U.,JohnsonJ.,SpindlerR.,TomaliaD.A.,BakerJ.R.,Jr.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1996,93:4897−4902）。本研究通过可降解的化学键将一类大小可控的水溶性聚合物与一些低代数的树枝状阳离子聚合物连接起来，从而得到了一系列新型的可生物降解的高效低毒性的树枝状聚阳离子材料。通过研究，我们发现这类材料对基因和药物有很好的携带和递送能力，而且效率高，毒性小，生物降解性好，是一类很有潜力的基因药物载体。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种树枝状基因药物载体，即一类可生物降解的高效低毒性的树枝状聚阳离子化合物(Dendriticcationicpolymer)，具有如下结构式：其中：R为二代AB3型树枝状阳离子聚合物（AB3-DendeimerG2），结构式为：n为八分支聚乙二醇每个支链中的重复单元的个数；m为直链聚乙二醇中的重复单元的个数。本专利技术的第二个目的是提供这一类新型树枝状聚阳离子化合物的制备方法，通过以下步骤实现（以8armPEG-SS-PEG-DendrimerG2为例）：1、二代树枝状分子（化合物4）的制备：称取一定量的化合物1溶解于质量体积比20-40倍的二氯甲烷中，向其中加入用量为化合物1物质的量的3-5倍的活化剂1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑（HOAt）并加入HOAt物质的量2-4倍量的催化剂三乙胺，常温搅拌5-20分钟后，加入用量为化合物1物质的量的5-10倍的N-叔丁氧羰基乙二胺，然后在0-5摄氏度的条件下缓缓，加入用量为HOAt物质的量的2-4倍的1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDCI），加完后保持0-5摄氏度反应0.5-2小时，再常温反应3-5小时。反应完毕后，向反应液中加入一定体积的乙酸乙酯，有机相用0.1-0.5摩尔/升的盐酸洗2-4次，用一定体积的饱和碳酸氢钠溶液洗2-4次，用一定体积的饱和氯化钠溶液洗1-2次，再用一定量的无水硫酸钠干燥，旋蒸。然后将所得中间产物溶解于质量体积比10-20倍的甲醇中，向其中加入化合物2物质的量的1-2倍的六水合氯化镍，然后在0-5摄氏度的条件下缓慢加入化合物2物质的量的3-10倍的硼氢化钠。加完后，在0-5摄氏度反应0.3-0.5小时，然后室温反应3-5小时。反应完毕后，用0.5-2摩尔/升的盐酸溶液将pH值调节至酸性，然后再用饱和碳酸氢钠溶液将pH值调节至碱性。将溶液中的甲醇旋蒸掉，再用乙酸乙酯萃取2-4次，有机相用饱和氯化钠溶液洗1-2次，用无水硫酸钠干燥，然后浓缩，用柱层析分离的方法得到化合物2。称取一定量的化合物2、化合物2物质的量的0.05-0.08倍的化合物3和化合物2物质的量的1.5-3倍的HOAt溶解于质量体积比20-40倍的二氯甲烷中，加入HOAt物质的量2-4倍量的催化剂三乙胺，然后在0-5摄氏度的条件下加入HOAt物质的量2-4倍量的EDCI，加完后控制0-5摄氏度反应1-3小时，之后常温反应30-50小时。反应完毕后，向反应液中加入一定体积乙酸乙酯，有机相用一定体积的0.1-0.5摩尔/升的盐酸洗2-4次，用一定体积的饱和碳酸氢钠溶液洗2-4次，用一定体积的饱和氯化钠溶液洗1-2次，再用一定量的无水硫酸钠干燥，过滤旋蒸，剩余残渣用柱层析分离的方法得到中间产物。然后将所得中间产物于0-5摄氏度条件下溶解在质量体积比30-50倍三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶剂中，常温搅拌10-20小时，之后用一定截留分子量的透析袋在水中透析20-40小时，冷冻干燥后得到二代树枝状分子（化合物4）。2、含有双硫键的水溶性内核分子（化合物6）的制备：将一定量多分支水溶性内核化合物5溶解于质量体积比3-5倍的二甲基亚砜中，然后称取活化羟基的连接剂，用量为多分支化合物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一类树枝状聚阳离子化合物，其特征在于，结构式如下：其中：R为二代AB3型树枝状阳离子聚合物，结构式为：n为八分支聚乙二醇每个支链中的重复单元的个数；m为直链聚乙二醇中的重复单元的个数。

【技术特征摘要】
1.一类树枝状聚阳离子化合物，其特征在于，结构式如下：其中：R为二代AB3型树枝状阳离子聚合物，即AB3-DendeimerG2，结构式为：n为八分支聚乙二醇每个支链中的重复单元的个数；m为直链聚乙二醇中的重复单元的个数；n和m由聚乙二醇原料的分子量而定，其中八分支聚乙二醇，分子量为10000Da-40000Da；所述的直链聚乙二醇分子量为MW2000Da-5000Da。2.根据权利要求1所述的一类树枝状聚阳离子化合物的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现，以8armPEG-SS-PEG-DendrimerG2为例：（1）化合物4的制备：化合物1溶解于二氯甲烷中，向其中加入活化剂1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑并加入催化剂三乙胺，常温搅拌，之后加入N-叔丁氧羰基乙二胺，然后缓缓加入1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐，加完后继续反应，反应完毕后，向反应液中加入乙酸乙酯，有机相依次用盐酸、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，再用无水硫酸钠干燥，旋蒸，得到中间产物，将中间产物溶解于甲醇中，向其中加入六水合氯化镍，然后缓慢加入硼氢化钠，加完后继续反应，反应完毕后，用盐酸溶液将pH值调节至酸性，再用饱和碳酸氢钠溶液将pH值调节至碱性，将溶液中的甲醇旋蒸掉，再用乙酸乙酯萃取，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥，然后浓缩，用柱层析分离的方法得到化合物2；将化合物2、化合物3和1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑溶解于二氯甲烷中，加入催化剂三乙胺，然后加入1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐，加完后继续反应，反应完毕后，向反应液中加入乙酸乙酯，有机相依次用盐酸、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，再用无水硫酸钠干燥，过滤旋蒸，剩余残渣用柱层析分离的方法得到中间产物，然后将所得中间产物溶解于三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶剂中，常温搅拌，之后用水透析，冷冻干燥后得到化合物4；（2）化合物6的制备方法：将化合物5溶解于二甲基亚砜中，然后将连接剂溶解于二甲基亚砜中，并加入三乙胺，在氮气保护下避光将化合物5的溶液滴加至连接剂的溶液中，继续反应，之后将反应液加入乙醚和四氢呋喃混合溶液中，静置，过滤得到沉淀即中间产物，将中间产物溶解于二甲基亚砜中，再将胱胺二盐酸盐溶解于二甲基亚砜中，并加入三乙胺，搅拌至完全溶解，将该中间产物的溶液缓慢滴加至胱胺的溶液中，继续反应，反应完毕后，溶液用水透析，冰冻干燥得到中间产物，再将该中间产物溶解于二甲基亚砜中，再将单侧活化的直链聚乙二醇溶解于二甲基亚砜中，将该中间产物的溶液滴加入聚乙二醇的溶液中，搅拌反应，之后将反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：王凯，汤谷平，周峻，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33