本发明专利技术公开了具有广谱免疫原性的人源轮状病毒减毒株以及由该减毒株制备得到的疫苗，本发明专利技术的一种具有广谱免疫原性的人源轮状病毒减毒株，命名HRV-LZ-2013，基因分型为G10P8，所述疫苗株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.9452。实验证明本发明专利技术中的轮状病毒减毒株保持了对动物的低致病性。在动物上，特别是在轮状病毒腹泻模型兔子和猪上的免疫保护实验表明，由本发明专利技术制备的减毒活疫苗或灭活疫苗在动物试验中均显示了良好的免疫保护性，对牛、羊的免疫保护实验更说明本发明专利技术的疫苗免疫保护范围广，可用于预防牛、猪、马、羊、犬等由轮状病毒所引起的腹泻。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了具有广谱免疫原性的人源轮状病毒减毒株以及由该减毒株制备得到的疫苗，本专利技术的一种具有广谱免疫原性的人源轮状病毒减毒株，命名HRV-LZ-2013，基因分型为G10P8，所述疫苗株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.9452。实验证明本专利技术中的轮状病毒减毒株保持了对动物的低致病性。在动物上，特别是在轮状病毒腹泻模型兔子和猪上的免疫保护实验表明，由本专利技术制备的减毒活疫苗或灭活疫苗在动物试验中均显示了良好的免疫保护性，对牛、羊的免疫保护实验更说明本专利技术的疫苗免疫保护范围广，可用于预防牛、猪、马、羊、犬等由轮状病毒所引起的腹泻。 CGMCC No.9452 2014.07.08【专利说明】具有广谱免疫原性的人源轮状病毒减毒株以及由该减毒株 制备得到的疫苗
本专利技术涉及一种轮状病毒减毒株及由该减毒株制备得到的疫苗，特别涉及一种安 全且具有广谱免疫原性的人源轮状病毒减毒株、由该减毒株制备得到的疫苗及其制备方 法，本专利技术属于轮状病毒感染的防治
。
技术介绍
轮状病毒（RV)引起腹泻在发展中国家是一种严重的传染性疾病，每年引起约5万 5岁以下儿童死亡。轮状病毒属于呼肠孤病毒科，分A、B、C 3个群，在人和动物中都有感染。 轮状病毒三层外壳蛋白内有11个不分节的双链RNA，外壳蛋白VP7、VP4是病毒诱导中和抗 体产生的主要免疫原，内膜蛋白VP6是亚群的分类依据。目前根据VP7和VP4基因分型发 现有27G和35P血清型轮状病毒。人的轮状病毒的流行病学研究中发现，普遍流行以G1、 G2、G3、G4和P、P、P单独或混合感染为主，也流行G9P，中国主要流行G1P、 G3P 、G2P 、G4 ，少有 P2、P4 流行。 采用单价人、动物和人-动物重配减毒疫苗口服免疫是预防轮状病毒引起的腹 泻、引起死亡和减少住院、腹泻症状的主要手段。 轮状病毒感染在人和动物中非常普遍，是发展中国家的严重经济负担，也是威胁 人类健康的公共卫生问题。为预防轮状病毒感染，全球已经开发了口服多价或单价的轮状 病毒疫苗，临床效果显示安全和有效，但动物和人轮状病毒的多样性以及轮状病毒的流行 性和自身特点，使得减毒活疫苗的使用仍存在安全隐患，如动物和人轮状病毒的变异、重 组，人和动物病毒的跨种属传播等，因此开发一种安全广谱的疫苗显得更加迫切。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种具有广谱免疫原性的人源轮状病毒减毒株。 本专利技术的目的之二在于提供一种用于预防轮状病毒感染所引起的疾病的减毒活 疫苗或灭活疫苗及其制备方法。 为了达到上述目的本专利技术采用了以下技术手段： 本专利技术专利技术人于2011年在国内某医院收集儿童急性轮状腹泻病粪便样本10例， 用20% PBS (pH = 7. 3)重悬无菌过滤，3000g离心20分钟，吸取0. Iml上清液加入胰酶 (20ug/ml)混合30分钟，接种经PBS洗涤3次单层MA-104细胞（T-25细胞培养液含MEM、 双抗（100U庆大霉素和IOOug链霉素）和8-10%胎牛血清），37°C孵育1小时，加入病毒 维持液（含MEN和0· 5ug/ml胰酶）在37°C培养10-15天，冻融3次再以2000g离心20分 钟，取上清液和胰酶（20ug/ml)混合30分钟后用MEM稀释20倍接种MA104细胞在37°C培 养8-9天，重复传代8-10代至病毒潜伏期至2-3天。分离得到的病毒经Vero细胞分离传 代15代，分离的病毒能够在猴肾细胞上稳定增值且具有细胞病变效应。 经基因分型鉴定，由本专利技术分离得到的轮状病毒（命名为HRV-LZ-2013)的基因型 为G10P8。与其它报道的人轮状病毒GlO型核苷酸序列不一致，与动物轮状病毒LLR株G核 苷酸同源性<90%。该株P型核苷酸序列与轮状病毒同源性> 90%。RNA-SDS PAGE试验 表明其11节RNA属于长型。 本专利技术的一种具有广谱免疫原性的人源轮状病毒减毒株，命名为HRV-LZ-2013， 基因分型为G10P8,分类命名为人轮状病毒，其菌种保藏编号为：CGMCC No. 9452,保藏时间 是：2014年7月8日，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物 研究所；保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。 经本专利技术分离得到一种轮状病毒减毒株HRV-LZ-2013,其在细胞上病毒滴度高，传 代稳定，用该毒株制备减毒活疫苗，对动物低致病性或无致病性，安全、广谱。制备灭活疫 苗，经灭活和纯化，病毒结构仍能够保持完整并可诱导多种动物产生中和抗体，从而对异型 病毒的攻击产生保护。 因此，进一步的，本专利技术还提出了一种轮状病毒疫苗，其特征在于其有效成分为本 专利技术所述的具有广谱免疫原性的人源轮状病毒减毒株或其传代株，抑或是所述具有广谱免 疫原性的人源轮状病毒减毒株的灭活抗原。 其中，优选的，所述的传代株是HRV-LZ-2013减毒株在Vero细胞上连续传代 20-100代所获得的减毒株。 更进一步的，本专利技术还提供了一种制备轮状病毒减毒活疫苗以及灭活疫苗的方 法。 其中，一种制备轮状病毒减毒活疫苗的方法，其特征包括以下步骤： (1)病毒的增殖培养 Vero细胞按20-30万个/ml接种转瓶，37 °C培养3天后，将轮状病毒HRV-LZ-2013 或其传代株按MOI 0. 01-0. 1接种，37°C培养1小时后，生理盐水洗后加入病毒维持液，所 述病毒维持液为含〇. 1 %的牛血清的MEM，pH 7. 2, 32°C培养3-5天，反复冻融3次，离心除 去细胞碎片，采用MA104细胞测定病毒滴度，滴度> 5. 51ogCCID5(l/ml且无菌为合格疫苗原 液； (2)轮状病毒HRV-LZ-2013的纯化 采用连续蔗糖密度梯度离心法，在含有60%蔗糖的TNE缓冲液中120000g离心10 小时，取出浮力密度为I. 36g/ml的纯化原液，电镜观察合格后重悬稀释到PH = 7. 0含10% 山梨糖的Hanks平衡液中； (3)加入适宜抗动物胃酸的轮状病毒保护剂，制成液体或冻干口服剂型。 其中，一种制备轮状病毒灭活疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤： (1)病毒的增殖培养 Vero细胞按20-30万个/ml接种转瓶，37 °C培养3天后，将轮状病毒HRV-LZ-2013 按MOI 0. 01-0. 1接种，37°C培养1小时后，生理盐水洗后加入病毒维持液，所述病毒维持液 为含0. 1 %的牛血清的MEM，pH 7. 2. 32°C培养3-5天，反复冻融3次，离心除去细胞碎片，采 用MA104细胞测定病毒滴度，滴度彡5. 51ogCCID5(l/ml且无菌为合格疫苗原液； (2)轮状病毒HRV-LZ-2013的纯化 采用连续蔗糖密度梯度离心法，在含有60%蔗糖的TNE缓冲液中120000g离心10 小时，取出浮力密度为I. 36g/ml的纯化原液，电镜观察合格后重悬稀释到PH = 7. 0含10% 山梨糖的Hanks平衡液中； (本文档来自技高网...
【技术保护点】
具有广谱免疫原性的人源轮状病毒减毒株，命名为HRV‑LZ‑2013，基因分型为G10P8，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.9452。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吕宏亮，张澍，
申请(专利权)人：吕宏亮，张澍，
类型：发明
国别省市：北京;11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。