香蕉水通道蛋白基因启动子及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种香蕉水通道蛋白基因启动子，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。利用香蕉水通道蛋白基因启动子构建一种表达Gus基因的植物重组表达载体pCAMBIA1304：MaPIP1；1-Promoter。本发明专利技术利用启动逆境相关基因的高效表达，应用于耐旱和耐盐的转基因植物中，对于解决干旱和盐害地区粮食危机、生态恶化等问题都有积极意义。

【技术实现步骤摘要】
香蕉水通道蛋白基因启动子及其应用
本专利技术涉及植物基因工程
，具体是指一种香蕉水通道蛋白基因启动子和在植物中高效表达的干旱和盐害的应用。
技术介绍
水资源短缺以及土壤盐渍化是目前制约农业生产的一个全球性问题，全球约有20％的耕地受到盐害威胁。干旱与盐害严重影响植物的生长发育，造成作物减产，并使生态环境日益恶化。在自然条件下，由于环境胁迫而严重影响了作物生长发育，其遗传潜力难以发挥，干旱、盐渍不仅影响了作物的产量，而且限制了植物的广泛分布，因此，提高作物的抗旱、耐盐能力已经成为现代植物研究工作中急需解决的关键问题之一。香蕉是热带、亚热带地区的重要经济作物之一，被联合国粮农组织(FAO)定位为发展中国家仅次于水稻、小麦、玉米之后的第四大粮食作物。香蕉前期植株较小，根系浅生，易受旱、盐害等胁迫的影响，在栽培生产中，耗水量大，缺水会减少香蕉果实数量且使香蕉变小，挂果期受旱，会影响果实膨大，在营养生长阶段遇上干旱，会使香蕉营养器官生长发育不良，从而造成减产。而土壤盐分过多使根际土壤溶液渗透势降低，促使植物吸收水分困难，造成生长速度和生长量显著下降，严重还可能造成死亡(Vanetal.,2011)。解决香蕉生产中严重的逆境胁迫问题，提高香蕉产量，除了常规育种技术以外，基于基因遗传转化的生物育种技术是一个重要的选择。在基因工程中，用来控制目的基因表达的启动子主要以CaMV35S等组成型表达启动子为主。该启动子虽能使目的基因过量表达，但它是无环境、组织和时间特异性的组成型表达的启动子。利用组成型表达启动子控制抗性相关基因的过量表达虽然可以提高植物在逆境条件下的抗逆能力，但正常环境条件下细胞内也会过量表达抗逆蛋白，对植物来说是一种能量浪费。因此，利用逆境诱导型启动子实现高效、可控和特异(定点、定时、定量)的调控抗逆基因在改良作物的抗性中成为当前研究的热点。对植物在干旱和盐害等逆境胁迫下大量表达的抗逆基因启动子研究表明，不同耐旱和耐盐基因的启动子往往含有相同的顺式作用元件，并受相同的反式作用因子的调控。非生物胁迫如干旱、高盐、低温等，可以诱导植物体内相关基因表达，其转录调节的主要机制是逆境胁迫有关的转录因子(调节蛋白)与基因上游启动子中关键顺式元件特异结合，增强启动子的活性，提高目的基因的表达量。国内外有一些关于逆境启动子的报道，干旱诱导型启动子，拟南芥erd1(earlyresponsivetodehydrationstress1)基因与干旱胁迫相关，其启动子区域存在保守的干旱响应顺式作用元件(Drought-Responsivecis-Element)CATGTG和CACG模体，融合GUS检测其表达谱发现，它在盐胁迫下叶片中特异性增强转录水平(Tranetal.,2004)。SNAC1(STRESS-RESPONSIVENAC1)是NAC家族的一员，超表达植株抗旱性大大增强，在受到干旱胁迫时能够正常结实，该基因的启动子驱动GFP表达情况揭示其受到干旱诱导在保卫细胞中特异性表达(Huetal.,2006)。rd29A启动子受ABA、干旱、高盐及低温等逆境诱导，是目前抗逆植物基因工程中应用最广泛的诱导型启动子(李新玲等，2007；杨春霞等，2008；吴梅花等，2005；Yamaguehi一shinOZakiandshinOZaki，1993)。Yamaguehi一shinozaki等(2001)分别利用CaMV355组成型启动子和rd29A逆境诱导型启动子获得了DREBIA的转基因植株，结果显示rd29A::DREBIA转基因植株的胁迫耐性明显高于355::DREBIA的转基因植株，表明rd29A启动子能更有效地提高植物对低温、干旱和高盐等逆境胁迫的适应性。Brown等(2001)首次在冬麦中发现了受低温诱导的blt101.1基因启动子，并通过渐变缺失鉴定到了一个高度保守的T-like元件(TCATCTTCTT)，表明该元件与诱导目的基因在低温胁迫下高效表达密切相关。Takumi等(2003)在小麦种分离到一个低温应答基因WCOr15上游1.7kb的启动子序列，结果显示该区段内包含有4个CRT/DRElike序列，包括CCGAC核心基序，实验证明该启动子受低温和光诱导。利用逆境诱导型启动子驱动抗逆基因的高效表达，从而改良作物对逆境胁迫的适应性已成为目前的研究热点。然而，目前能应用于转基因研究的诱导型启动子仍然很少。因此，对于新的逆境相关启动子的克隆、顺式作用元件具体序列的确定、各元件之间的相互作用，以及与这些元件互作的转录因子的研究仍然是今后启动子研究的重点。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题就是提供一种香蕉水通道蛋白基因启动子，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。该序列长度为841bp。通过对该启动子序列中的顺式作用元件进行预测分析，发现该启动子具有响应干旱和高盐的元件，含有1个响应干旱元件CBFHV，1个ABA和干旱响应元件DRE2COREZMRAB17，1个干旱、高盐响应元件DRECRTCOREAT，1个早期响应干旱元件MYCATERD1。本专利技术还提供了一种用于获得香蕉水通道蛋白基因启动子的引物对，所述引物对为：正向兼并引物：5'-NTCGASTWTSGWGTT-3'(5'-NTCGA(G/C)T(A/T)T(G/C)G(A/T)GTT-3')；三轮反向引物：第一轮反向引物pr1：5'-AAACAGTGTAGACGAGGATGAAGGTG-3'；第二轮反向引物pr2：5'-GGTACAGTAGACCAAGGCAAAGAT-3'；第三轮反向引物pr3：5'-CCTGTAGAAGGACCAAGAGGTGAGC-3'。本专利技术还提供了一种香蕉水通道蛋白基因启动子的获得方法，该方法以具有香蕉水通道蛋白基因的香蕉基因组DNA为模板，采用以下引物对：正向兼并引物：5'-NTCGASTWTSGWGTT-3'；三轮反向引物：第一轮反向引物pr1：5'-AAACAGTGTAGACGAGGATGAAGGTG-3'；第二轮反向引物pr2：5'-GGTACAGTAGACCAAGGCAAAGAT-3'；第三轮反向引物pr3：5'-CCTGTAGAAGGACCAAGAGGTGAGC-3'。进行三轮PCR扩增，其所获得的香蕉水通道蛋白基因启动子为SEQIDNO.1。本专利技术还提供了一种重组表达载体，它含有权利要求1所述香蕉水通道蛋白基因启动子的植物表达载体。所述植物表达载体为pCAMBIA1304。该表达载体可使外源目的基因的高效表达。本专利技术还提供了一种重组表达载体的构建方法，包括以下步骤：1)以香蕉水通道蛋白基因启动子SEQIDNO.1为模板设计引物对，且引物对分别上加ECORI、SPeI酶切位点和保护碱基：正向引物P1：5'-CGGAATTCATCGAGTATGGTGTTCCTATGCT-3'，反向引物P2：5'-GGACTAGTCTATCACTATCTATCTCCCCTGT-3'；2)以香蕉水通道蛋白基因启动子SEQIDNO.1为模板进行PCR，PCR扩增条件如下：94℃预变性3min；94℃变性40s、55℃退火40s、72℃延伸40s，共35个循环；72℃延伸8min；获得PCR产物；3)用ECORI、SPeI将PC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种香蕉水通道蛋白基因启动子，其特征在于；其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种香蕉水通道蛋白基因启动子，其特征在于；其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.用于获得权利要求1所述香蕉水通道蛋白基因启动子的引物对，其特征在于；所述引物对为：正向兼并引物：5'-NTCGASTWTSGWGTT-3'；三轮反向引物：第一轮反向引物pr1：5'-AAACAGTGTAGACGAGGATGAAGGTG-3'；第二轮反向引物pr2：5'-GGTACAGTAGACCAAGGCAAAGAT-3'；第三轮反向引物pr3：5'-CCTGTAGAAGGACCAAGAGGTGAGC-3'。3.一种权利要求1所述香蕉水通道蛋白基因启动子的获得方法，其特征在于：以具有香蕉水通道蛋白基因的香蕉基因组DNA为模板，采用以下引物对：正向兼并引物：5'-NTCGASTWTSGWGTT-3'；三轮反向引物：第一轮反向引物pr1：5'-AAACAGTGTAGACGAGGATGAAGGTG-3'；第二轮反向引物pr2：5'-GGTACAGTAGACCAAGGCAAAGAT-3'；第三轮反向引物pr3：5'-CCTGTAGAAGGACCAAGAGGTGAGC-3'。进行三轮PCR扩增，其所获得的香蕉水通道蛋白基因启动子为SEQIDNO.1。4.一种重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为含有权利要求1所述香蕉水通道蛋白基因启动子的植物表达载体。5.根据权利要求4所述的重组表达载体，所述植物表达载体为pCAMBIA1304。6.一种权利要求4或5所述重组表达载体的构建方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：许奕，金志强，徐碧玉，刘菊华，贾彩红，张建斌，胡伟，苗红霞，王卓，王甲水，李羽佳，王安邦，宋顺，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院海口实验站，
类型：发明
国别省市：海南;66