制备固定有抗原的免疫荧光载片的方法，所述方法包括：将C反应蛋白固定在载片上制备蛋白芯片；将能够特异结合靶蛋白的抗体与链霉亲和素混合从而给抗体标记上荧光纳米颗粒；通过竞争混合与抗体免疫反应，利用荧光照相机分析，其中C反应蛋白在载片上的固定包括：用3-氨丙基三甲氧基硅烷修饰载片来制备经过修饰的载片；将3-氨丙基三甲氧基硅烷修饰的载片水合；利用戊二醛溶液活化修饰过的载片；将C反应蛋白以0.01-0.5mg/ml的浓度溶解在30-70mM磷酸盐缓冲液(pH6.5-7.8)中从而制备用于固定的抗原溶液；将容纳载片的培养皿放在点样模板上，在点样点上加1-100μl抗原溶液；和在如上制备的载片上反应1-6小时以便固定抗原。利用所述方法制备的免疫荧光载片。
【技术实现步骤摘要】
固定有抗原的免疫荧光载片的制备方法和由该方法制备的 免疫荧光载片 本申请是申请日为2011年2月21日、申请号为201180019524.X(国际申请号为 PCT/KR2011/001126)、名称为固定有抗原的免疫荧光载片的制备方法和由该方法制备的 免疫荧光载片的专利技术专利申请的分案申请。
本专利技术涉及制备抗原固定化免疫荧光载片的方法，所述方法包括：将C反应蛋白 固定在载片上制成蛋白芯片，将能够特异结合靶蛋白的抗体与链霉亲和素混合给抗体标记 上荧光纳米颗粒，通过竞争性混合使抗体进行免疫反应，用荧光照相机进行检验；并涉及用 所述方法制备的免疫荧光载片。
技术介绍
生物芯片包括多种类型的固定在固体支持物单位表面上的探针，使用这类生物芯 片时，仅需少量样品，即可很方便地大规模进行疾病诊断、高通量筛选（HTS)和酶活测量。 多数将探针固定在载片上的方法包括将探针固定在用包被材料预先处理过的玻 璃载片上。已有多种表面化学材料被提议用于这些方法，例如可以使用自组单层膜（韩国 专利公开 2003-0038932)。 这方面，作为提高被固定探针的量和维持探针活性的一个试验，开发建立了三维 (3D)固定方法（GillandBallesteros,TrendsinBiotechnology18:282, 2000)。这类3D 固定方法的例子有使用PackardBioscience的HydlOgeIK包被载片的方法、使用Biocept Company的基于聚乙二醇的水凝胶的方法和使用LGChemicalCo.，Ltd的solgel的方法等。 用于免疫传感器的载片选自玻璃、硅、水凝胶、金属、陶瓷和多孔膜。 当前，根据抗原或抗体的特异反应性，通过将抗体或抗原固定在基片上制成的抗 体或抗原探针板被广泛用于检测。这类应用中有代表性的试剂盒是快速检验试剂盒、常规 检验试剂盒和生物芯片试剂盒。 这些试剂盒被用于检测固定化抗体探针或抗原探针所对应的靶抗原或靶抗体。 某些情况中，多种反应基团被组装到单个探针板上，这些反应基团中的每一个包 括用于检测抗原或抗体的测试条。 同时，随着HealthFunctionalFoodAct的生效，即使在韩国也有可能制造基于 天然材料的食物物料和加工食品，并且获得认可是健康功能性食品。然而，为了做到这一 点，需要提供材料从技术上证明健康功能性食品的功能，例如预防心血管疾病、防衰老、预 防癌症、预防肥胖、调节免疫功能或者预防胃肠道相关疾病。相应地，食品功能评估变得更 重要，因此功能评估有更高的商业化价值。 食品功能评估包括根据那六种功能类型进行的体外功能评估、用实验动物（比如 大鼠）进行的体内功能评估和临床试验。就食品工业来说，对开发体内功能检测技术的需 求增加，所述检测技术可以利用实验动物快速有效地对食物物料和功能性食品进行功能评 估。 要被认可为功能性食品，需要具有科学上证实的目标功能，比如心血管功能，食品 功能评估的重要性如何强调都不为过（Kim et al·，Detecting C-reactive protein by using direct binding quartz crystal microbalance immunosensor, Journal of The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering，Vol. 22, p. 443, 2007) 〇 传统 上，在临床试验前使用实验动物进行的体内功能评估是为了评估身体因素，比如体重、血压 和器官状况的变化。但是，这种方法产生的结果不一致，而且要求评估方案的变化性，技术 高超的专业人员和高成本的检测仪器。统一的体内食品功能评估方法是测量实验动物（比 如大鼠）中与特定疾病或代谢症状相关的特定生物标记物的增加或减少。从这方面，含有 希望被认可为功能性食品的食品被给予实验动物。 韩国专利10-921237公开的一种快速检测食物物料和功能性食品 的心血管功能方法是通过利用石英晶体微天平型免疫传感器高灵敏度检 测 C-反应蛋白的方法（Biosensors and Bioelectronics, Vol. 19,P. 1193， 2004 ； Cl ini cal Chemistry,Vol.47,p. 403, 2001 ；New England Journal of Medicine，Vol. 340, p. 448, 1999 ;Biochemical Journal，Vol. 327, p. 425, 1997)，其中所述 c-反应蛋白是一种已知是冠状动脉疾病、高血压等的主要生物标记物的五聚体蛋白，其由 白介素-6和白介素-1β诱导刺激在哺乳动物肝脏内合成，具有大约118千道尔顿（kDa) 的分子量。 与检测C反应蛋白的酶联免疫分析法（ELISA) (American Journal of C ardiology,Vol. I,p. 155, 2005 ；American Journal of Veterinary Research, Vol. 1，p. 62，2005 ； J o u r n a I of Clinical Laboratory AnalySis，V〇l. 18，p. 280,2004)相比，该方法易于使用，测量不需被着色物质干扰，并且比 其他典型传感器测量方法有更好或等同的测量灵敏度（Biosensors and Bioelectronics， Vol. 22, p. 973, 2007 ；Biosensors and Bioelectronics, Vol. 21, p. 1987, 2006 ；Biosensors and Bioelectronics, Vol. 21, p. 1631, 2006 ；Biosensors and Bioelectronics，Vol. 21，p. 1141, 2006 ；Analytical Biochemistry, Vol. 328, p. 210, 2004)〇 近年，使用生物传感器的传感器测量方法更常使用的是纳米材料，比如金属胶体、 纳米碳管、荧光二氧化硅纳米颗粒或半导体量子点，这类纳米材料的使用促使传感器信 号有更高的灵敏度、稳定性或选择性（Analytical Chemistry，Vol. 79, p. 630-707, 2007 ; Biosensors and Bioelectronics, Vol. 21, p. 1900, 2006 ；Langmuir, Vol. 22, p. 4357, 2006 ； Nano Letters,Vol. 5,p. 113, 2005 ；Biosensors and Bioelectronics,Vol. 20, p. 2454 ,2005 ；Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol. 100,p.4984, 2003 ； Biochemical and Biophysical Research Communicat本文档来自技高网...
【技术保护点】
制备固定有抗原的免疫荧光载片的方法，所述方法包括：将C反应蛋白固定在载片上制备蛋白芯片；用荧光纳米颗粒标记能够特异结合C反应蛋白的抗体；将由标本获得的靶蛋白与荧光标记抗体混合，使混合液与载片上固定的抗原反应；以及通过利用荧光显微镜测量荧光强度或荧光颗粒的数量进行分析，其中C反应蛋白在载片上的固定包括：通过将载片在包含浓盐酸和甲醇的混合液(HCl:MtOH＝1:1‑1:2，体积比)中浸泡15‑45分钟来洗涤载片；对载片进行硅烷化，方法是，制备3‑巯基丙基三甲氧基硅烷溶液，其中将1‑3％的3‑巯基丙基三甲氧基硅烷溶液溶于选自甲苯和二甲基甲酰胺的有机溶剂中，用与制备3‑巯基丙基三甲氧基硅烷溶液所用的相同的有机溶剂将载片的前表面和后表面洗三到四次；用1‑3mM N‑γ马来酰亚胺基丁酰氧基琥珀酰亚胺酯溶液活化载片表面；将0.01‑0.5mg/ml的C反应蛋白溶解在30‑70mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5‑7.8)中从而制备用于固定的抗原溶液；将含有载片的培养皿放在点样模板上，在各个点样点上加1‑100μl抗原溶液；和在如上制备的载片上反应1‑6小时以便固定抗原。
【技术特征摘要】
2010.02.23 KR 10-2010-00161571. 制备固定有抗原的免疫荧光载片的方法，所述方法包括：将C反应蛋白固定在载片 上制备蛋白芯片；用荧光纳米颗粒标记能够特异结合C反应蛋白的抗体；将由标本获得的 靶蛋白与荧光标记抗体混合，使混合液与载片上固定的抗原反应；以及通过利用荧光显微 镜测量荧光强度或荧光颗粒的数量进行分析， 其中C反应蛋白在载片上的固定包括： 通过将载片在包含浓盐酸和甲醇的混合液（HCl=MtOH = 体积比）中浸泡 15-45分钟来洗涤载片； 对载片进行娃烧化，方法是，制备疏基丙基二甲氧基娃烧溶液，其中将的3-疏 基丙基三甲氧基硅烷溶液溶于选自甲苯和二甲基甲酰胺的有机溶剂中，用与制备3-巯基 丙基三甲氧基硅烷溶液...
【专利技术属性】
技术研发人员：金南洙，赵镛珍，金钟泰，
申请(专利权)人：韩国食品研究院，
类型：发明
国别省市：韩国;KR
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