针对前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶KEXIN 9型(PCSK9)的抗原结合蛋白制造技术

本发明专利技术阐述了与前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin 9型(PCSK9)相互作用的抗原结合蛋白。阐述了通过给予药物有效量的针对PCSK9的抗原结合蛋白治疗高胆固醇血症及其它疾病的方法。阐述了用针对PCSK9的抗原结合蛋白检测样品中PCSK9的量的方法。

【技术实现步骤摘要】
针对前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶KEXIN9型（PCSK9)的抗 原结合蛋白 本申请为分案申请，原申请的申请日为2008年8月22日，申请号为 200880113475. 4(PCT/US2008/074097)，专利技术名称为针对前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶 kexin9型（PCSK9)的抗原结合蛋白。 相关申请 本申请要求享有于2007年8月23日提交的美国临时申请顺序号60/957, 668、于 2007年12月21日提交的美国临时申请顺序号61/008, 965及于2008年1月9日提交的美 国临时申请顺序号61/010, 630的优先权，它们以其整体在此引作参考。 专利
本专利技术涉及结合前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型（Proprotein convertase subtilisin kexintype9，PCSK9)的抗原结合蛋白及使用和制备所述抗原 结合蛋白的方法。本申请连同电子格式的序列表一起提交。所提供的序列表文件名为 APM0L-003A.txt，于2008年8月12日创建，且大小为296,639字节，其被更新为文件名为 APM0L-003A_Substitute. TXT的文件，该文件于2010年10月11日星期二创建且大小为 297, 239字节。该电子格式的序列表中的信息以其全部内容通过引用结合到本文中。 各种实施方案背景 前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型（PCSK9)是丝氨酸蛋白酶，其参与调节 低密度脂蛋白受体（LDLR)蛋白的水平（Horton等，2007 ;Seidah和Prat，2007)。体外实 验显示将PCSK9加到H印G2细胞能降低细胞表面LDLR水平（Benjannet等，2004 ;Lagace 等，2006 ;Maxwell等，2005 ;Park等，2004)。对小鼠的实验显示，提高PCSK9蛋白水平能降 低肝脏 LDLR 蛋白水平（Benjannet 等，2004 ;Lagace 等，2006 ;Maxwell 等，2005 ;Park 等， 2004)，同时PCSK9敲除小鼠提高肝脏中LDLR水平（Rashid等，2005)。另外，业已鉴定了提 高或降低血浆LDL水平的各种人PCSK9突变（Kotowski等，2006 ;Zhao等，2006)。业已显 示PCSK9直接与LDLR蛋白作用，与LDLR -起被吞噬，在整个内体途径中与LDLR共发生免 疫荧光（Lagace等，2006)。尚未观察到PCSK9降解LDLR，且未确定其降低胞外LDLR蛋白水 平的机制。 PCSK9是丝氨酸蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶（S8)家族中的激素原-前蛋白转化 酶（Seidah等，2003)。人类有9种激素原-前蛋白转化酶，可将其分为S8A和S8B亚家族 (Rawlings 等，2006)。弗林蛋白酶、PC1/PC3、PC2、PACE4、PC4、PC5/PC6 和 PC7/PC8/LPC/ SPC7被分在亚家族S8B中。来自鼠弗林蛋白酶和PCl的不同结构域的晶体结构及NMR结构 显示了枯草杆菌蛋白酶样前域（pro-domain)及催化结构域，并且P结构域（Pdomain)直接 位于催化结构域的C-末端（Henrich等，2003 ;Tangrea等，2002)。基于该亚家族内的氨基 酸序列的相似性，预测所有7个成员都具有相似的结构（Henrich等，2005)。SKI-1/S1P和 PCSK9被分在亚家族S8A中。这些蛋白之间的序列比较也提示存在枯草杆菌蛋白酶样前域 及催化结构域（Sakai等，1998;Seidah等，2003;Seidah等，1999)。在这些蛋白中，位于催 化结构域的C-末端的氨基酸序列更易变，且未提示存在P结构域。 激素原-前蛋白转化酶作为酶原表达，它们经过多个步骤加工成熟。在该加工中 前域的功能是双重的。前域首先起分子伴侣作用，为催化结构域的适当折叠所需（Ikemura 等，1987)。当催化结构域折叠后，在前域和催化结构域之间发生自身催化。在该初次裂解 反应后，前域仍然与催化结构域结合，然后其起着催化活性抑制物的作用（Fu等，2000)。当 条件恰当时，在前域内的位点处因第二次自身催化事件继续成熟（Anderson等，1997)。在 该第二次裂解事件发生后，前域和催化结构域分离，成为活性蛋白酶。 PCSK9 酶原的自身催化发生在 Glnl52 和 Serl53 (VFAQI SIP)之间（Naureckiene 等，2003)，业已显示为其从细胞分泌所需（Seidah等，2003)。尚未观察到在PCSK9前域内 位点处的第二自身催化事件。纯化的PCSK9由两部分构成，它们可通过非还原性SDS-PAGE 分开；为17Kd的前域和为65Kd的催化结构域加上C-末端结构域。尚未分离到没有其抑制 性前域的PCSK9, PCSK9的催化活性的测量值一直是不定的（Naureckiene等，2003 ;Seidah 等，2003)。 各种实施方案概述 在某些实施方案中，本专利技术包括针对PCSK9的抗原结合蛋白。 在某些方面，本专利技术包括结合PCSK9的分离的抗原结合蛋白，其包含：A)选自以 下的一个或多个重链互补决定区（CDRH) :(i)来自选自以下的序列中的CDRHl的CDRHl : SEQ ID N0:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、 79、80、76、77、78、83、69、81 和 60 ; (ii)来自选自以下的序列中的 CDRH2 的 CDRH2 :SEQ ID N0:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、 76、77、78、83、69、81和60 ;(iii)来自选自以下的序列中的CDRH3的CDRH3:SEQIDN0:74、 85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、 78、83、69、81和60 ;和（iv)含有一处或多处不超过4个氨基酸的氨基酸取代、缺失或插入 的⑴、（ii)和（iii)的CDRH ;B)选自以下的一个或多个轻链互补决定区（CDRL):⑴来 自选自以下的序列中的 CDRLl 的 CDRLl :SEQ ID N0:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44 和 46 ; (ii)来自选自以下 的序列中的 CDRL2 的 CDRL2 :SEQ ID N0:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44和46;(1^)来自选自以下的序列中的 CDRL3 的CDRL3 :SEQ ID N0:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离的中和抗原结合蛋白，所述中和抗原结合蛋白结合包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的PCSK9蛋白，其中所述中和抗原结合蛋白降低PCSK9对LDLR的降低LDLR的作用。

【技术特征摘要】
2007.08.23 US 60/957668;2007.12.21 US 61/008965;201. 分离的中和抗原结合蛋白，所述中和抗原结合蛋白结合包含SEQ ID NO: 1的氨基酸 序列的PCSK9蛋白，其中所述中和抗原结合蛋白降低PCSK9对LDLR的降低LDLR的作用。2. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的分离的中和抗原结合蛋白，其中所述抗原 结合蛋白为LDLR非竞争性中和抗原结合蛋白。3. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的分离的中和抗原结合蛋白，其中所述抗原 结合蛋白为LDLR竞争性中和抗原结合蛋白。4. 选择性结合PCSK9的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白以小于100 pM的Kd结 合PCSK9。5. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白以 小于10 pM的Kd结合。6. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白以 小于5 pM的Kd结合。7. 结合SEQ ID NO: 1的PCSK9蛋白的分离的抗原结合蛋白，其中在所述分离的抗原 结合蛋白与PCSK9蛋白变体之间的结合小于所述分离的抗原结合蛋白与SEQ ID NO: 1的 PCSK9蛋白之间的结合的50%。8. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的分离的人抗原结合蛋白，其中所述变体 PCSK9蛋白包含选自SEQ ID NO: 1所示的以下位置的残基的至少一个突变：207、208、185、 181、439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、 521 和 554。9. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的分离的人抗原结合蛋白，其中所述至少一 个突变选自 R207E、D208R、E181R、R185E、R439E、E513R、V538R、E539R、T132R、S351R、A390R、 A413R 和 E582R。10. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的分离的人抗原结合蛋白，其中所述至少 一个突变选自 D162R、R164E、E167R、S123R、E129R、A311R、D313R、D337R、R519E、H521R 和 Q554R。11. 以第一种方式结合SEQ ID NO: 303的PCSK 9蛋白的抗原结合蛋白，其中所述抗原 结合蛋白以第二种方式结合PCSK9变体，其中所述PCSK9变体具有在选自SEQ ID NO: 303 的以下位置处的至少一个点突变：207、208、185、181、439、513、538、539、132、351、390、413、 582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、521 和 554,其中所述第一种方式包含第一 EC50、第一 Bmax或第一 EC50和第一 Bmax，其中所述第二种方式包含第二EC50、第二Bmax 或第二EC50和第二Bmax，其中所述第一种方式的值不同于所述第二种方式的值。12. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述第一种方式 包含第一 EC50,其中所述第二种方式包含第二EC50,其中所述点突变选自：R207E、D208R、 E181R, R185E、R439E、E513R、V538R、E539R、T132R、S351R、A390R、A413R 和 E582R。13. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述第一 EC50与所 述第二EC50至少有20%不同。14. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述第一 EC50与所 述第二EC50至少有50%不同。15. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述第二EC50在数 值上大于所述第一 EC50。16. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述第一 EC50由多 元...

【专利技术属性】
技术研发人员：SM杰克逊，NPC沃克，DE皮佩尔，单倍，沈文彦，JCY陈，CT金，RR克彻姆，C梅林，TA卡拉贝奥，曹琼，
申请(专利权)人：安姆根有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US