本发明专利技术为一种检测牛GHR基因的特异性引物、其荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法和应用，提供一种牛GHR基因的荧光定量PCR检测试剂盒，试剂盒包括PCR反应液、TaqDNA聚合酶混合物、SYBRGreen染料和引物；所述引物序列为：上游序列为5’-AACCACCACCCAATACAG-3’，下游序列为5’-CAACGAGTACATCGGAAC-3’。本发明专利技术还提供上述试剂盒的检测方法和应用以及检测牛GHR基因的特异性引物。本发明专利技术实现了方便快捷的检测牛GHR基因mRNA表达水平的目的。本发明专利技术在检测基因mRNA表达水平方面具有灵敏度高、稳定性好、实验成本低的优点。本发明专利技术可以监测不同牛种（包括奶牛、黄牛和牦牛）的不同组织和不同时期的生长发育状态，同时可以鉴定与生长阻滞相关的疾病。
【技术实现步骤摘要】
一种检测牛GHR基因的特异性引物、其荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法和应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种检测牛GHR基因的特异性引物和牛GHR基因荧光定量PCR检测试剂盒。
技术介绍
聚合酶链式反应(Polymerase Chain React1n, PCR)是DNA体外操作技术中最常用的技术。PCR技术将模板DNA、特异性引物、dNTPs底物、耐热DNA聚合酶、镁离子等放在同一个缓冲反应体系中，进行反复高温变性、低温退火、中温链延伸的热循环，实现靶DNA片段在反应液中呈2n倍扩增(其中η为热循环次数)。 荧光定量PCR技术是在变通PCR反应的基础上，结合实时荧光检测技术和计算机分析技术。荧光定量PCR在变通PCR反应体系中加入特定的荧光标记物质，通过检测每个热循环后PCR反应体系中的荧光值的变化情况来实时监测DNA的扩增情况，并获得每个样本的荧光定量变化曲线，进而获得每个反应管的Ct值(荧光变化达到阈值时的循环数)；同时，在相同的反应体系和反应条件下检测2-10个倍数稀释的已知数量的靶标DNA，获得其Ct值，以起始模板数的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标制备标准曲线，据此标准曲线和各个标本的Ct值对每个反应的起始DNA模板数进行定量测定。 虽然Northern blot技术可检测基因的mRNA表达水平,但整个实验过程操作比较复杂。Northern blot实验中一个主要的问题是存在RNA的降解,所以Northern Blot中所有的实验用品都需要经过除去RNA酶的过程，如高温烘烤、DEPC处理等。另外，NorthernBlot中很多实验用品如甲醛、EB、DEPC、紫外灯等等对人体都有一定的伤害。基因芯片实验虽然降低了实验人员的工作量，并可以在一次实验中同时检测几千个基因表达量变化，但是其灵敏度较低。 而SYBR Green是一种结合于双链DNA小沟中的结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强。该性质用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green的最大吸收波长约为497 nm，发射波长最大约为520 nm。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 SYBR Green在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。此外，由于一个PCR产物可以与多分子的染料结合，因此SRYB Green的灵敏度很高。但是，由于SYRBGreen与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBR Green得到定量结果。 生长激素(Growth Hormone，GH)是调节动物生长发育的一个重要分泌因子。GH在组织和细胞水平发挥作用的第一步就是和靶细胞表面的GHR结合，再由GHR介导将信号传入细胞内从而产生一系列的生理效应。组织中GHR量的多少将影响GH生理效应的发挥。因此，在牛的饲养过程中和科学研究中，可以定量检测组织中GHR的表达量，达到监测牛的发育状况的目的。
技术实现思路
本专利技术提供了一种牛生长激素受体(Growth Hormone Receptor,GHR)基因的突光定量PCR检测试剂盒。通过大量的实验研究，我们优化出了一套能够有效检测不同牛种(包括奶牛、黄牛和牦牛)GHR基因表达量的引物和PCR反应的条件，并组装成GHR基因表达检测荧光定量聚合酶链式反应试剂盒，以满足生命科学、医学和畜牧兽医研究者的检测需要。为此，本专利技术还提供检测牛GHR基因的特异性引物、检测方法和试剂盒的应用。 为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供的技术方案如下:一种检测牛GHR基因的特异性引物，其核苷酸序列为: 上游序列为 5’ -AACCACCACCCAATACAG-3’， 下游序列为 5’ -CAACGAGTACATCGGAAC-3’。 本专利技术还提供一种牛GHR基因的荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括PCR反应液、Taq DNA聚合酶混合物、SYBR Green染料和引物；所述引物序列为: 上游序列为 5’ -AACCACCACCCAATACAG-3’， 下游序列为 5’ -CAACGAGTACATCGGAAC-3’。 进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。 本专利技术的第三个目的是提供一种牛GHR基因的定量检测方法，是以待测cDNA为模板，利用权利要求1所述的引物和SYBR Green染料进行实时荧光定量PCR，记录Ct值，并以GHR标准基因作为阳性对照绘制标准曲线，据此标准曲线和Ct值进行定量测定。 进一步地，所述实时荧光定量PCR的反应条件是:95 °C预变性30秒；95 °C 5秒，56 °C 20秒,捕捉突光信号,循环40次。 本专利技术的第四个目的是提供上述试剂盒在定量检测牛GHR基因中的应用。 进一步地，所述牛为奶牛、黄牛和牦牛。 与现有最好技术相比，本专利技术的优点在于:1.本专利技术实现了方便快捷的检测GHR基因mRNA表达水平的目的。 2.本专利技术在检测基因mRNA表达水平方面具有灵敏度高、稳定性好、实验成本低的优点。 3.本专利技术可以监测不同牛种(包括奶牛、黄牛和牦牛)的不同组织和不同时期的生长发育状态，同时可以鉴定与生长阻滞相关的疾病。 【附图说明】 附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中: 图1为GHR基因转录水平的荧光检测结果图，A:扩增曲线。横坐标为PCR循环次数，纵坐标为相对荧光量值(Relative Fluorescence Units, RFU), B:熔解曲线，横坐标为温度，纵坐标为单位温度下相对荧光值的变化量。 【具体实施方式】 以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。 本专利技术的GHR基因的荧光定量PCR检测试剂盒由以下组分组成:2XSYBR GREEN MIX5mL ； 引物混合液500μ?; 超纯水5mL ；阳性对照:标准GHR基因模板50 μ L。 其中，2ΧSYBR GREEN MIX 由以下组分组成:Taq DNA 聚合酶 0.1 U/μ L、dNTPs 底物 0.4 mmol/L、Mg2+ 5.0 mmol/LUOO mmol/L KC1、20 mmol/L Tris.HCl PH8.3、0.02 % 明胶和 20 ng/mL SYBR Green 染料。 引物混合液:上游引物8 μ mol/L、下游引物8 μ mol/L，上游引物序列为5’ -AACCACCACCCAATACAG-3’，下游引物序列为 5’ -CAACGAGTACATCGGAAC本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测牛GHR基因的特异性引物，其核苷酸序列为：上游序列为5’‑AACCACCACCCAATACAG‑3’，下游序列为5’‑CAACGAGTACATCGGAAC‑3’。
【技术特征摘要】
1.一种检测牛GHR基因的特异性引物，其核苷酸序列为: 上游序列为 5’ -AACCACCACCCAATACAG-3’， 下游序列为 5’ -CAACGAGTACATCGGAAC-3’。2.—种牛GHR基因的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包括PCR反应液、Taq DNA聚合酶混合物、SYBR Green染料和引物；所述引物序列为: 上游序列为 5’ -AACCACCACCCAATACAG-3’， 下游序列为 5’ -CAACGAGTACATCGGAAC-3’。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于:所述试...
【专利技术属性】
技术研发人员：裴杰，褚敏，梁春年，郭宪，包鹏甲，冯瑞林，朱新书，丁学智，阎萍，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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