一种培育高抗TYLCV番茄的方法技术

本发明专利技术公开了一种培育高抗TYLCV番茄的方法，具体是选择TYLCV基因组中AV1基因、AC1基因和AC3基因的片段嵌合得到多基因嵌合体AV1-AC1-AC3，并构建回文序列的干扰载体RNAi；通过农杆菌介导在番茄子叶中瞬时表达dsRNA，得到转化多基因嵌合体AV1-AC1-AC3的转基因番茄；转基因番茄经过TYLCV的系统侵染后表现为对TYLCV抗性，未观察到明显的发病症状，具有高抗TYLCV性能，从而筛选出高抗TYLCV番茄。本发明专利技术可在2个月内快速筛选和培育出高抗TYLCV番茄株系，大大缩短了培育周期，为防治TYLCV提供了技术支持。

【技术实现步骤摘要】
一种培育高抗TYLCV番茄的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种培育高抗TYLCV番茄的方法。
技术介绍
番茄黄化曲叶病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus,TYLCV)属于双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)，是植物病毒中唯一一类具有孪生颗粒形态的单链环状DNA(singlestrandedDNA,ssDNA)病毒。TYLCV基因组编码六个ORF：在病毒链上的AV1和AV2，在互补链上的AC1、AC2、AC3和AC4。AV1编码的是病毒的外壳蛋白(coatprotein,CP)，与病毒的包壳、介体传播及与寄主互作相关；AV2编码是移动蛋白(moveprotein,MP)相关的蛋白，主要起到协助移动蛋白的功能；AC1编码病毒复制相关蛋白(replication-associatedprotein,Rep)，参与病毒基因组DNA的复制起始；AC2编码的蛋白是一个转录激活子(transcriptionalactivator,TrA)，该蛋白能激活DNA-A和DNA-B病毒链上的基因转录；AC3编码一个复制增强蛋白(replicationenhancerprotein,REn)，但对病毒侵染力不起决定作用)；AC4编码的蛋白参与病毒的复制或转录调控。TYLCV病发病症状主要表现为：顶端叶片边缘黄化且上卷，叶脉间叶肉发黄，植株上部叶片变小，整个叶片萎缩，褶皱，植株生长变缓或停滞，节间缩短，明显矮化，致使产量和质量降低。1991年，我国首次在广西南宁发现该病毒。从2006年起，该病毒在北京、山西、江苏、上海、广东、广西、云南等地相继发现，并对当地的番茄生产造成了巨大的损失。预防为主、防治结合是防治番茄黄化曲叶病毒病的主要原则，目前主要通过调整栽培结构、防治烟粉虱、加强田间管理以及选用抗病品种等措施对该病进行综合防治。但这些方法成本高、效果不够理想，有时甚至会给环境带来负面影响，而进行抗病品种选育是最有效的途径之一。在TYLCV的抗病性育种方面，国外研究的比较早，目前国外一些国家的科研人员已经以野生抗病番茄品系为材料，通过杂交选育和基因工程得到了一些抗病或耐病的商业品种。但传统的杂交育种艰苦费时，从而大大限制了育种工作的进展。与之相比，基因工程育种具有明显的优越性：1)育种周期短；2)适用范围广，尤其适用于传统育种因缺乏抗原而难以进行的抗CMV育种；3)在育种过程中不会引入其它不良农艺性状的基因等。因此，基因工程在番茄抗病毒病育种中的应用日益受到人们的重视。当前，番茄抗病毒病基因工程主要采用转病毒外壳蛋白(CP)基因的方法，获得了转烟草花叶病毒外壳蛋白基因番茄，培育出了能稳定遗传的抗病毒植株。除病毒的外壳蛋白基因外，目前在番茄上主要采用卫星RNA、反义RNA以及RNAi等方法获得不同程度的抗病毒番茄。目前，转基因的大部分的注意力都集中于单个的AC1蛋白、AV1蛋白或干扰TYLCV在番茄内的复制、转移的其它蛋白基因。这种转基因的方法获得的高抗转基因植物的几率较小，且该策略还存在异源重组等生态安全性的问题。RNA沉默机制的发现和应用，为抗病毒基因工程提供了新的途径，该方面的研究在国际、国内已经广泛深入进行。但是，所有抗TYLCV的商业杂交种均为单个抗性基因导入，当TYLCV大规模发生时，它们的抗病能力有限甚至下降，仍会造成严重的经济损失。为保障我国番茄产业可持续发展，促进菜农增产增收，进行更高抗TYLCV的番茄新品种的研究选育工作刻不容缓。有研究表明，通过聚合不同抗源的基因以提高植物对多种病毒的抗性是提高一个品种抗病能力的重要策略之一。2005年，白庆荣等在烟草中转入PVX-CP和PVY-CP嵌合基因并获得了6株对两种病毒免疫的转基因株系；2008年，朱常香等获得了同时对PVY、TMV和CMV这3种病毒都有抗性的烟草；2011年，牛颜冰等获得同时对两种病毒(TMV和CMV)免疫的转基因烟草；至今为止，国内外尚未有关利用基因技术聚合同一抗源的不同基因来提高植物对特定病毒高抗性的研究报道，因此进行高抗TYLCV番茄新品系的多嵌合基因沉默技术及相关研究具有重大意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种培育高抗TYLCV番茄的方法，针对目前TYLCV对番茄的产量和质量的严重危害，采用基因瞬时表达来快速筛选并培育对TYLCV具有高抗性的高抗TYLCV番茄，大大缩短筛选周期。为了达到上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种培育高抗TYLCV番茄的方法，包括如下步骤：1)将TYLCV的AV1基因片段、AC1基因片段和AC3基因片段嵌合得到多基因嵌合体AV1-AC1-AC3，并构建反向重复序列的RNAi载体；其中，AV1、AC1和AC3基因片段的核苷酸序列分别如SEQIDNo.1，SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示，多基因嵌合体AV1-AC1-AC3的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。2)利用农杆菌介导法将RNAi载体在番茄上瞬时表达得到转化多基因嵌合体AV1-AC1-AC3的转基因番茄。3)转基因番茄经过TYLCV系统性侵染、鉴定抗病性，获取对TYLCV具有抗性的高抗TYLCV番茄。一种快速筛选并培育高抗TYLCV番茄的方法，包括如下步骤：1)以感病番茄中提取的总DNA为模板，利用三对引物AV1F/AV1R，AC1F/AC1R和AC3F/AC3R分别进行PCR扩增AV1基因片段，AC1基因片段和AC3基因片段，所述AV1、AC1和AC3基因片段的核苷酸序列分别如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示；引物AV1F/AV1R，AC1F/AC1R和AC3F/AC3R的序列具体为：AV1F：CGCGGATCCGAGCTCATTCGTCTTAACACAV1R：ATATTTATTAAAATCATAGAAAAC3F：TTTCTATGATTTTAATAAATATAC3R：TTCAAATTAAAGTATTTAAATAAC1F：TATTTAAATACTTTAATTTGAAAC1R：GCTCTAGAGCGGCCGCGATCTGAGTCC2)将如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示的PCR产物混合，以引物AV1F和AC1R进行PCR扩增，得到多基因嵌合体AV1-AC1-AC3，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。多基因嵌合体AV1-AC1-AC3与载体pGEM-TEasyVector连接，得到质粒pGEM-T-AV1-AC1-AC3。3)使用限制性内切酶XbaI和BamHI双酶切质粒pGEM-T-AV1-AC1-AC3和克隆载体pBluescriptIISK(-)-RTM1，将酶切片段和载体进行连接，得到重组质粒pBluescriptIISK(-)-AV1-AC1-AC3-RTM1。4)使用限制性内切酶SacI和NotI双酶切质粒pBluescriptIISK(-)-AV1-AC1-AC3-RTM1和质粒pGEM-T-AV1-AC1-AC3，将酶切片段和载体进行连接，得到重组质粒pBluescriptIISK(-)-AV1-AC1-AC3(i/r)。5)将构建的干扰片段AV1-AC1-AC3从重组质粒pBlues本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种培育高抗TYLCV番茄的方法，包括如下步骤：1)将TYLCV的AV1基因片段、AC1基因片段和AC3基因片段嵌合得到多基因嵌合体AV1‑AC1‑AC3，并构建反向重复序列的RNAi载体；其中，AV1、AC1和AC3基因片段的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1，SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，多基因嵌合体AV1‑AC1‑AC3的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；2)利用农杆菌介导法将RNAi载体在番茄上瞬时表达得到转化多基因嵌合体AV1‑AC1‑AC3的转基因番茄；3)转基因番茄经过TYLCV系统性侵染、鉴定抗病性，获取对TYLCV具有抗性的高抗TYLCV番茄。

【技术特征摘要】
1.一种培育高抗TYLCV番茄的方法，包括如下步骤：1)将TYLCV的AV1基因片段、AC1基因片段和AC3基因片段嵌合得到多基因嵌合体AV1-AC1-AC3，并构建反向重复序列的RNAi载体；其中，AV1、AC1和AC3基因片段的核苷酸序列分别如SEQIDNo.1，SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示，多基因嵌合体AV1-AC1-AC3的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；2)利用农杆菌介导法将RNAi载体在番茄上瞬时表达得到转化多基因嵌合体AV1-AC1-AC3的转基因番茄；3)转基因番茄经过TYLCV系统性侵染、鉴定抗病性，获取对TYLCV具有抗性的高抗TYLCV番茄。2.一种培育高抗TYLCV番茄的方法，包括如下步骤：1)以感病番茄中提取的总DNA为模板，利用三对引物AV1F/AV1R，AC1F/AC1R和AC3F/AC3R分别进行PCR扩增AV1基因片段，AC1基因片段和AC3基因片段，所述AV1、AC1和AC3基因片段的核苷酸序列分别如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示；引物AV1F/AV1R，AC1F/AC1R和AC3F/AC3R的序列具体为：AV1F：CGCGGATCCGAGCTCATTCGTCTTAACACAV1R：ATATTTATTAAAATCATAGAAAAC1F：TATTTAAATACTTTAATTTGAAAC1R：GCTCTAGAGCGGCCGCGATCTGAGTCCAC3F：TTTCTATGATTTTAATAAATATAC3R：TTCAAATTAAAGTATTTAAATA2)将PCR产物混合，以引物AV1...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙胜，邢国明，邢晓娟，亢秀萍，陈志峰，李兴桃，许小勇，
申请(专利权)人：山西农业大学，
类型：发明
国别省市：山西;14