基于微卫星标记和隶属函数法研究玉米种质的耐深播性制造技术

基于微卫星标记和隶属函数法研究玉米种质的耐深播性，主要步骤：（1）采用PVC管进行深播试验，在3cm、15cm和20cm三种播深处理下共同探讨耐深播性与相关性状的关系，筛选出耐深播鉴定指标及适宜的筛选深度。（2）利用隶属函数法评价各自交系的耐深播性大小。（3）利用70对多态性微卫星标记分析51份自交系的耐深播遗传多样性。（4）结合自交系在三种播深下的性状表现，耐深播性评价结果及耐深播种质微卫星标记结果来挖掘玉米耐深播种质类群。此方法从形态学和分子生物角度研究了玉米种质的耐深播性，重复性强，结果可靠，能够大大提高耐深播种质筛选与应用效率。

【技术实现步骤摘要】
基于微卫星标记和隶属函数法研究玉米种质的耐深播性
本专利技术属于农业新品种选育
，涉及玉米自交系耐深播性鉴定指标的筛选方法，特别涉及基于微卫星标记和隶属函数法筛选玉米耐深播种质的方法。
技术介绍
种子萌发阶段是作物能否在干旱条件下完成生育周期的关键时期之一，苗期遇干旱时出苗能力下降，保苗率降低，严重影响田间苗数，从而导致减产。玉米对干旱比较敏感，干旱缺水不仅阻碍玉米生长发育，干扰生理过程，而且严重影响产量，深播是玉米苗期避旱的重要途径之一,研究玉米种质资源的耐深播特性对干旱地区玉米生产和耐深播育种具有重要意义。作物的耐深播性是受多种因素综合作用的一个非常复杂的遗传性状，机理极其复杂，且易受环境影响，因此这给作物的耐深播性研究带来了诸多困难。目前玉米的耐深播性虽有报道，学者普遍认为出苗率是耐深播种质鉴定的重要指示指标，但是对玉米其它耐深播种质鉴定指标的筛选罕见报道。学者已经提出了一些作物耐深播评价方法。张磊等（张磊,刘志增,黄亚群,陈景堂,祝丽英.46个玉米自交系耐深播特性分析.河北农业大学学报,2007,30(3):18-21.）在15cm播深下，利用根茎长评价了玉米自交系的耐深播性；张晓龙等（张晓龙,陈佳慧,林琪,兰进好.小麦新品系耐深播特性分析.农业科技通报,2009,6:49-51,51.）在小麦上利用供试材料的平均地中茎长，并做Duncan多重比较，评价了小麦品系的耐深播性；彭云玲等（彭云玲,杨芳林,赵小强,任续伟.不同玉米自交系耐深播能力的差异分析.干旱地区农业研究，2014,，32(1)：25-32.）在15cm播深下，利用出苗率、中胚轴长、胚芽鞘长、中胚轴与胚芽鞘之和、苗长、根长、根数等7个性状对45份自交系进行聚类分析，评价了各材料的耐深播性。虽然利用这些方法也能评价作物的耐深播特性，但是这些方法只注重了个别指标，或模糊的将材料聚成不同类型，而对材料的耐深播性缺乏全面地评价，也不清楚材料的耐深播性大小，更不清楚玉米耐深播种质类群，因此给玉米耐深播种质筛选和应用带来了很大的盲目性。微卫星标记，也称为简单重复序列（simplesequencerepeats、SSR），作为一种新兴的分子标记，在遗传多样性分析、基因定位、分子标记辅助育种等领域具有重要意义。由于隶属函数法能够综合多种因素对作物的某一性状进行评价，因此该方法对作物的性状评价具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供基于微卫星标记和隶属函数法筛选玉米耐深播种质的方法。以此筛选出广泛适合于玉米耐深播性鉴定的参考指标及适宜的筛选深度；提出一种玉米耐深播性综合评价新方法并进行耐深播性评价；在此基础上，分别结合材料的性状表现及耐深播性评价结果，从分子生物学角度挖掘玉米耐深播种质类群，进一步了解耐深播种质的遗传多样性，为耐深播种质的筛选与应用提供理论依据。为了解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：基于微卫星标记和隶属函数法筛选玉米耐深播种质的方法，包括如下步骤：（1）收集材料：收集51份玉米自交系材料；（2）种子清选：在51份材料中分别选取饱满一致、无破损的种子10粒各10份；（3）深播试验：采用PVC盆栽试验法，往尼龙网封底的高40cm、直径15cm的PVC管中分层装入蛭石，然后分别将步骤（2）所得的51份自交系的种子10粒均匀地播于蛭石上，再分别盖3cm、15cm和20cm蛭石使管内蛭石高度达40cm。其中3cm为对照处理，15cm和20cm为两个深播处理，每一处理3次重复，播前统一配土、装钵、浇水；在室内条件下萌发10d后统计出苗率，每一处理选取整体一致的幼苗6株测定其胚芽鞘长、中胚轴长、中胚轴与胚芽鞘之和、苗长及根长；（4）培养黄化苗：51份自交系各取10粒种子先用ddH2O清洗2次，再用体积百分比为75%的酒精消毒10min，最后用ddH20冲洗3次，将种子放在灭过菌且铺有两层滤纸的培养皿上，浇适量ddH2O，放置培养箱中25℃进行暗培养，待黄化苗长至3~5cm时迅速剪其黄化苗，装入自封袋中编号，-70℃保存；（5）DNA提取：用CTAB法提取步骤（4）所得的自交系黄化苗全基因组DNA，用质量百分比为1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，用德国IMPLEN微量分光光度仪检测DNA浓度；（6）PCR扩增：PCR反应在Biometra-T1PCR仪上进行，采用10uL反应体系，包括Mix5.0uL，1mmol/L正、反SSR引物各0.3uL，ddH2O3.7uL，50ng/uLDNA0.7uL；PCR反应程序为：95℃预变性5min，1个循环；94℃变性30s，50-59℃退火30s，72℃延伸30s，共36个循环；最后72℃延伸10min，4℃结束并保存；扩增产物用质量百分比为8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染；（7）筛选SSR标记：从玉米基因组数据库网站（http://www.MaizeGDB.org）中选择了均匀分布于玉米全基因组的230对SSR引物，由上海生工生物工程有限公司合成；选择黄早四、掖478、丹340、齐319、Mo17和B73这6份国内玉米杂种优势群的标准测验种为多态性SSR引物筛选材料，用步骤（5）所得的这6份自交系的DNA，同时进入步骤（6），若上述6份自交系PCR扩增产物在两份或两份以上自交系间有差异，则认为这对引物为多态性引物，总共筛选出了70对条带清晰、多态性好的SSR引物；（8）耐深播种质的微卫星标记：用步骤（7）所得的70对SSR引物和步骤（5）所得51份自交系的DNA同时进入步骤（6），分析51份自交系的耐深播遗传多样性；（9）结果分析：对步骤（3）测得的数据用统计软件SPSS16.0的相关程序进行方差分析、相关分析及描述统计，筛选出玉米耐深播性鉴定指标及适宜的筛选深度，利用隶属函数法对51份自交系的耐深播性进行综合评价，评价每一自交系的耐深播性；用Patentinversion3.5软件生成70对多态性SSR引物序列，对步骤（8）统计的数据用NTYSY-pc2.1软件分析51份自交系的耐深播遗传多样性并划分种质类群；最后结合自交系在三种播深下的性状表现、耐深播性综合评价结果及耐深播种质微卫星标记结果来挖掘玉米耐深播种质类群。本专利技术以51份玉米自交系为试材，在3cm、15cm和20cm三种播深处理下，进行深播试验来共同探讨出苗率、胚芽鞘长、中胚轴长、中胚轴与胚芽鞘之和、苗长及根长与耐深播性的关系，以此筛选出广泛适合于玉米耐深播性鉴定的参考指标及适宜的筛选深度；根据耐深播鉴定指标及适宜的筛选深度，用隶属函数法对51份自交系的耐深播性进行综合评价；结合各自交系在三种播深下的性状表现，耐深播性综合评价结果及耐深播种质微卫星标记结果确定了玉米耐深播种质类群。本专利技术提供的方法在室内进行，重复性好，结果可靠，不仅能综合多种环境、多个耐深播相关性状，从形态学客观、准确地评价玉米种质的耐深播性大小，还从分子生物学角度揭示了耐深播种质类群，因此大大提高了耐深播玉米种质的筛选、应用效率与目的性，为玉米耐深播育种奠定了坚实的基础，具有很高的应用价值。本领域的技术人员清楚，玉米自交系种子试验材料并非限于51份，本专利技术以51份玉米自交系种子试验材料为例，是为了清楚描写技术方案的内容。附图说明图本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于微卫星标记和隶属函数法研究玉米种质的耐深播性，其特征在于包括如下步骤：（1）收集材料：收集51份玉米自交系材料；（2）种子清选：在51份材料中分别选取饱满一致、无破损的种子10粒各10份；（3）深播试验：采用PVC盆栽试验法，往尼龙网封底的高40cm、直径15cm 的PVC管中分层装入蛭石，然后分别将步骤（2）所得的51份自交系的种子10粒均匀地播于蛭石上，再分别盖3cm、15cm和20cm蛭石使管内蛭石高度达40cm；其中3cm为对照处理，15cm和20cm为两个深播处理，每一处理3次重复，播前统一配土、装钵、浇水；在室内条件下萌发10d后统计出苗率，每一处理选取整体一致的幼苗6株测定其胚芽鞘长、中胚轴长、中胚轴与胚芽鞘之和、苗长及根长；（4）培养黄化苗：51份自交系各取10粒种子先用ddH2O清洗2次，再用体积百分比为75%的酒精消毒10min，最后用ddH20冲洗3次，将种子放在灭过菌且铺有两层滤纸的培养皿上，浇适量ddH2O，放置培养箱中25℃进行暗培养，待黄化苗长至3~5cm时迅速剪其黄化苗，装入自封袋中编号，‑70℃保存；（5）DNA提取：用CTAB法提取步骤（4）所得的自交系黄化苗全基因组DNA，用质量百分比为1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，用德国IMPLEN微量分光光度仪检测DNA浓度；（6）PCR扩增：PCR反应在Biometra‑T1PCR仪上进行，采用10uL反应体系，包括Mix5.0uL，1mmol/L正、反SSR引物各0.3uL，ddH2O 3.7uL，50ng/uL DNA0.7uL；PCR反应程序为：95℃预变性5min，1个循环；94℃变性30s，50‑59℃退火30s，72℃延伸30s，共36个循环；最后72℃延伸10 min，4℃结束并保存；扩增产物用质量百分比为8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染；（7）筛选SSR标记：从玉米基因组数据库网站（http://www.MaizeGDB.org）中选择了均匀分布于玉米全基因组的230对SSR引物，由上海生工生物工程有限公司合成；选择黄早四、掖478、丹340、齐319、Mo17和B73这6份国内玉米杂种优势群的标准测验种为多态性SSR引物筛选材料，用步骤（5）所得的这6份自交系的DNA，同时进入步骤（6），若上述6份自交系PCR扩增产物在两份或两份以上自交系间有差异，则认为这对引物为多态性引物，总共筛选出了70对条带清晰、多态性好的SSR引物；（8）耐深播种质的微卫星标记：用步骤（7）所得的70对SSR引物和步骤（5）所得51份自交系的DNA同时进入步骤（6），分析51份自交系的耐深播遗传多样性；（9）结果分析：对步骤（3）测得的数据用统计软件SPSS16.0的相关程序进行方差分析、相关分析及描述统计，筛选出玉米耐深播性鉴定指标及适宜的筛选深度，利用隶属函数法对51份自交系的耐深播性进行综合评价，评价每一自交系的耐深播性；用Patentin version3.5软件生成70对多态性SSR引物序列，对步骤（8）统计的数据用NTYSY‑pc2.1软件分析51份自交系的耐深播遗传多样性并划分种质类群；最后结合自交系在三种播深下的性状表现、耐深播性综合评价结果及耐深播种质微卫星标记结果来挖掘玉米耐深播种质类群。...

【技术特征摘要】
1.基于微卫星标记和隶属函数法筛选玉米耐深播种质的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）收集材料：收集51份玉米自交系材料；（2）种子清选：在51份材料中分别选取饱满一致、无破损的种子10粒各10份；（3）深播试验：采用PVC盆栽试验法，往尼龙网封底的高40cm、直径15cm的PVC管中分层装入蛭石，然后分别将步骤（2）所得的51份自交系的种子10粒均匀地播于蛭石上，再分别盖3cm、15cm和20cm蛭石使管内蛭石高度达40cm；其中3cm为对照处理，15cm和20cm为两个深播处理，每一处理3次重复，播前统一配土、装钵、浇水；在室内条件下萌发10天后统计出苗率，每一处理选取整体一致的幼苗6株测定其胚芽鞘长、中胚轴长、中胚轴与胚芽鞘之和、苗长及根长；（4）培养黄化苗：51份自交系各取10粒种子先用ddH2O清洗2次，再用体积百分比为75%的酒精消毒10min，最后用ddH20冲洗3次，将种子放在灭过菌且铺有两层滤纸的培养皿上，浇适量ddH2O，放置培养箱中25℃进行暗培养，待黄化苗长至3~5cm时迅速剪其黄化苗，装入自封袋中编号，-70℃保存；（5）DNA提取：用CTAB法提取步骤（4）所得的自交系黄化苗全基因组DNA，用质量百分比为1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，用德国IMPLEN微量分光光度仪检测DNA浓度；（6）筛选SSR标记：从玉米基因组数据库网站中选择了均匀分布于玉米全基因组的230对SSR引物，由上海生工生物工程有限公司合成；（7）PCR扩增：选择黄早四、掖478、丹340、齐319、Mo17和B73这6份国内玉米杂种优势群的标准测验种为多态性SSR引物筛选材料，用步骤（5）所得的这6份自交系的DNA在Biometra-T1PCR仪上进行PCR反应，所述PCR反应采用10反应体系，包括Mix5.0，1mmol/L正、反SSR引物各0.3，ddH2O3.7，50ng/DNA0.7；P...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭云玲，赵小强，闫慧萍，武博洋，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62