本发明专利技术公开了一种灰葡萄孢的早期快速分子检测方法，其步骤：（1）运用2对特异性引物对待鉴定菌株的基因组DNA进行LAMP扩增，所述的2对特异性引物的序列是：BC-F3；BC-B3；BC-FIP；BC-BIP；（2）利用上述引物在恒温条件下，进行LAMP扩增，取琼脂糖凝胶电泳分析或用染料法进行观察；（3）进行结果判断，观察电泳结果是否有梯形条带出现或加入染料后产物是否为绿色，如果有梯形条带出现或产物为绿色，说明DNA来源为灰葡萄孢，如果没有梯形条带出现或产物不变色，说明DNA来源不是灰葡萄孢。实现了对灰霉病发病早期的快速检测，准确的预测预报。检测灰霉病，具有操作简单易行、耗时短、灵敏度高、特异性强，结果判断简单可靠，具有广泛的实际应用价值。
【技术实现步骤摘要】
一种灰葡萄孢的早期快速分子检测方法
本专利技术属于植物病害的分子检测领域，具体涉及一种灰葡萄孢的早期快速分子的检测方法，可用于植物灰霉病的早期快速诊断及流行预测。
技术介绍
由灰葡萄孢（Botrytiscinerea）引起的灰霉病是一种在全世界广泛分布的重要植物病害。它可以侵染包括茄科、豆科和蔷薇科等数百种植物，在多种蔬菜的生产种植过程中也常造成严重的危害，可使蔬菜的产量减少20%以上，严重时可达60%以上。随着作物种植面积的不断增加，塑料大棚的使用也越来越多，而在大棚中灰葡萄孢的生长繁殖速度更快，这导致灰霉病的发生更加严重，而且灰霉病一旦发生，可迅速产生大量的分生孢子进行传播扩散，难以有效防治，从而造成更大的经济损失。因此灰霉病是限制多种作物和蔬菜品质和产量提高的主要因素之一。对于多种植物病害来说，在病害发生的早期进行针对性防治效果较好，因此针对特定病害发展快速特异的早期分子检测手段至关重要。这种早期检测技术有基于PCR的快速检测技术，也有基于环介导恒温扩增技术（LAMP）而建立起来的快速特异检测技术，LAMP技术的引物设计比普通PCR要复杂得多，它是针对目标基因的6个不同区域设计出来4条特异性引物，其中包括一对外引物及一对内引物，但LAMP技术相对于PCR技术具有灵敏度高和特异性强的特点；LAMP技术对扩增设备要求简单、反应时间短，通常在60分钟内可完成整个扩增反应，反应过程中不需要专业的PCR仪，只需要简单的水浴锅即可，易于农户操作，而且扩增所需费用低；同时LAMP的扩增结果通过添加燃料的方法可直接用肉眼观察，方便快捷。目前对于大多数的重要植物病害均开发出了一些基于PCR或LAMP的早期分子检测技术，其中也包括针对灰葡萄孢的早期检测技术。但对于已报道的检测技术来说，基于PCR技术设计的灰葡萄孢检测方法灵敏度有限，可检测的DNA为微克级，而基于LAMP技术的灰葡萄孢检测方法灵敏度虽可达纳克级，但并未对葡萄孢属其它种及其近缘属进行特异性检测区分。而已有报道显示葡萄孢属真菌包括灰葡萄孢、蚕豆葡萄孢、拟蚕豆葡萄孢等多个种的病原真菌，在田间这些病原菌并不能有效进行区分，从而延误病害的有效防治，因此需要借助特异性强、灵敏度高且简单易行的检测技术进行早期的检测区分。本专利技术依据华中农业大学李国庆课题组通过RAPD方法扩增获得的灰葡萄孢特异性片段进行LAMP的引物设计，专利技术了可用于科学研究及田间实践灰葡萄孢分子检测方法。利用本专利技术进行灰葡萄孢的早期检测，具有操作简单易行、耗时短、灵敏度高、特异性强，结果判断简单可靠的特点，具有广泛的实际应用价值，将其应用于灰霉病病的预测预报中，必将有利于田间灰霉病的综合管理，促进多种作物的增产增收。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种田间灰霉病发病早期的快速分子的检测方法，实现了对灰霉病发病早期的快速检测，为灰霉病的田间综合管理提供了科学、准确的预测预报。检测灰霉病，具有操作简单易行、耗时短、灵敏度高、特异性强，结果判断简单可靠的特点，具有广泛的实际应用价值。为了实现上述的目的，本专利技术采用以下技术方案：一种灰葡萄孢的早期快速分子的检测方法，其步骤是：1.依据华中农业大学李国庆课题组通过RAPD方法扩增获得的灰葡萄孢特异性片段为靶标，利用在线软件PrimerExplorer5.0设计LAMP引物，每一组LAMP引物包括两条外引物（F3，B3），上游内引物（FIP），下游内引物（BIP）。本专利技术使用的引物序列如下：BC-F3：5’-AATGATCGCCTACACAGC-3’BC-B3：5’-AGCTACCACCGAGAACAA-3’BC-FIP：5’-TCCCCTTAATAAATGTGATAGGCACCTGAACCGAAAGATTGAAAAGG-3BC-BIP：5’-TTAAGTGACACTTGATGAACGGATCGTTTTATAATCACGAATATGACAG-3’利用该引物在恒温（64℃）条件下，进行LAMP扩增，反应体系及程序如下：表1.LAMP的反应体系（25μL）成分体积10×ThermoPolBufer2.5μLdNTPs(10mmol/L)4.0μLMg2+(25mmol/L)6.0μLF3(10μmol/L)0.5μLB3(10μmol/L)0.5μLFIP(10μmol/L)3.5μLBIP(10μmol/L)3.5μLDNA模板1.0μLBstDNA聚合酶（8U/μL）1.0μLddH2O2.5μL反应程序为：64℃45min，85℃5min。2.利用步骤（1）的引物在恒温（64℃）条件下，进行LAMP扩增，取5μL产物于2.0％（质量体积比）琼脂糖凝胶电泳分析，进行结果判断，观察电泳结果是否有梯形条带出现，有梯形条带出现，DNA来源为灰葡萄孢，没有梯形条带出现，说明DNA来源不是灰葡萄孢。3.或用染料法进行观察，在扩增产物中加入1μL10%（质量体积比）的SYBRGreenI核酸染料（购买自Invitrogen公司），混匀后进行结果判断，观察加入染料后产物是否变色，产物为绿色，DNA来源为灰葡萄孢，产物不变色，说明DNA来源不是灰葡萄孢。本专利技术设计了一套灰葡萄孢特异性引物，并成功建立了一种可用于灰霉病病发病早期的快速检测方法。与其它检测方法相比，本专利技术具有如下优点：1．特异性强，本专利技术中设计的特异性引物不仅可以区分属于亲缘关系较远的不同属的常见植物叶部病原真菌，而且可以区分与灰葡萄孢同属于子囊菌亚门、盘菌纲、柔膜菌目的病原真菌核盘菌，并且可以区分葡萄孢属的多个种的真菌，参见附图1。2．灵敏度高，采用本专利技术优化的技术体系，可以检测下限至10fg的灰葡萄孢菌DNA，而已报道的两种灰葡萄孢快速检测方法的下限分别为0.4ug和1pg，灵敏度大大提高。3．采用本专利技术方法检测十分快速，1-2小时内即可得到准确的检测结果，并可以实时跟踪病害的发生发展情况，并进行及时的预测预报。而传统的微生物学检测则至少需要2天至1个星期以上。4.操作简单，本专利技术方法不需要复杂的仪器，只需要简单的水浴恒温设备，通过染料进行染色肉眼即可进行观察结果进行准确判断。附图说明图1为一种灰葡萄孢的早期快速分子检测方法对灰葡萄孢、其它葡萄孢属真菌及核盘菌分离物总DNA的检测结果示意图。A为用染料法进行观察，从1-12分别为以灰葡萄孢菌株B05.10、Bc-1、CanBc-3v及BC-Red、核盘菌1980菌株、葡萄孢属其它种菌株B.fabiopsis、B.fabae、B.sinoallii、B.squamosa、B.aclada、B.porri和B.byssoidea的基因组DNA为模版进行LAMP检测，结果可见只有1-4来自灰葡萄孢菌株的样品检测可见产物为绿色，其它来源样品DNA检测结果均未变色；B为用电泳法进行观察，M为分子量标记Marker，泳道1-12分别为以灰葡萄孢菌株B05.10、Bc-1、CanBc-3v及BC-Red、核盘菌1980菌株、葡萄孢属其它种菌株B.fabiopsis、B.fabae、B.sinoallii、B.squamosa、B.aclada、B.porri和B.byssoidea的基因组DNA为模版进行LAMP检测后产物电泳，结果可见只有1-4来自灰葡萄孢菌本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种灰葡萄孢的早期快速分子检测方法，其步骤是：（1）通过RAPD方法扩增获得的灰葡萄孢特异性片段为靶标，利用在线软件Primer Explorer 5.0设计LAMP引物，每一组LAMP引物包括两条外引物F3，B3，上游内引物FIP，下游内引物BIP，所述的2对特异性引物的序列分别是：BC‑F3：5’‑AATGATCGCCTACACAGC‑3’BC‑B3：5’‑AGCTACCACCGAGAACAA‑3’ BC‑FIP：5’‑TCCCCTTAATAAATGTGATAGGCACCTGAACCGAAAGATTGAAAAGG‑3BC‑BIP：5’‑TTAAGTGACACTTGATGAACGGATCGTTTTATAATCACGAATATGACAG‑3’，利用该引物在恒温条件下，进行LAMP扩增，LAMP反应体系及条件；（2）利用步骤（1）的引物在恒温条件下，进行LAMP扩增，取5 μL产物于2.0％质量体积比琼脂糖凝胶电泳分析或用染料法进行观察；（3）进行结果判断，观察电泳结果有梯形条带出现或加入染料后产物为绿色，有梯形条带出现或产物为绿色，DNA来源为灰葡萄孢，没有梯形条带出现或产物不变色，DNA来源不是灰葡萄孢。...
【技术特征摘要】
1.一种灰葡萄孢的早期快速分子检测方法，其步骤是：(1)通过RAPD方法扩增获得的灰葡萄孢特异性片段为靶标，利用在线软件PrimerExplorer5.0设计LAMP引物，每一组LAMP引物包括两条外引物F3，B3，上游内引物FIP，下游内引物BIP，所述的2对特异性引物的序列分别是：BC-F3：5’-AATGATCGCCTACACAGC-3’BC-B3：5’-AGCTACCACCGAGAACAA-3’BC-FIP：5’-TCCCCTTAATAAATGTGATAGGCACCTGAACCGAAAGATTGAAAAGG-3BC-BIP：5’-TTAAGTGACACTT...
【专利技术属性】
技术研发人员：程家森，李斌，姜道宏，付艳苹，谢甲涛，李国庆，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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