兰属微卫星标记的建立方法、核心指纹标记库与试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种兰属微卫星标记的建立方法、核心指纹标记库与试剂盒。基于建兰转录组信息开发SSR引物，对这些标记进行了通用性和多态性分析，得到了49个兰属多态性标记，这些标记多态性高、重复性好，非常适用于兰属植物的遗传学研究。另外，根据标记在兰属物种中的分辨能力构建了核心指纹标记库。获得的SSR指纹标记库不但标记稳定可靠，而且具有数量较少、物种分辨能力强的特点，能最大限度反映兰属物种间差异（不是种内差异）且便于统计，可用于兰属主要物种的鉴定。

【技术实现步骤摘要】
兰属微卫星标记的建立方法、核心指纹标记库与试剂盒
本专利技术属于分子遗传领域，涉及利用建兰的基因内部SSR的制备和生物统计的方法开发一个数量少、分辨率高的兰属主要物种指纹标记库。技术背景中国兰花通称国兰，属兰科(Oehidaeeae)兰属(Cymbidium)，主要包括春兰、蕙兰、寒兰、建兰和墨兰等。由于其具有很高的观赏价值和经济价值，所以目前国兰爱好者往往通过属内种间和甚至属间杂交，以便创造出更多的种质资源(所谓的科技草)，但同时也造成了兰属物种界限的模糊，在没有开花的时候，很难区分这些物种，这就给国兰的收藏爱好者造成了一定的困扰，而一个没有标准的行业和市场是不健康的。而分子标记是一种鉴定物种的高效并稳定的方法。微卫星标记(microsatellite,SSR)共显性、重复性好，操作简单和易检测，是目前主流的分子标记之一。目前，兰属植物的基因组比较大且整体信息未明，如果将基因组的SSR位点对供试种质一一进行分析鉴定，需耗费大量的人力和物力，是不现实的。因此，迫切需要一个数量少而精的指纹库。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种兰属微卫星标记的建立方法、兰属植物核心指纹标记库与试剂盒。在于从建兰转录组中开发适用于整个兰属植物的SSR标记，以用于后续兰属植物的遗传多样性、亲缘性以及遗传作图等多方面的研究，并从中筛选出若干高物种区分度的SSR标记构建兰属植物的指纹标记库。一种兰属微卫星标记的建立方法，步骤是：1)、建兰转录组序列的获得:选取建兰的花苞，提取总RNA，得到转录组序列片段(Reads)，去除干扰信息后，完成序列拼接，获得建兰的转录组非冗余序列(Unigene)；2)、建兰转录组非冗余序列中微卫星标记(SSR)位点的鉴定:采用SSR检索软件对Unigene进行SSR位点查找，从而获得一系列SSR位点，同时，分析Unigene的开放阅读框，然后根据这些开放阅读框来进一步确认SSR的位置；3)、建兰SSR引物的设计:选取进化选择压力小的SSR位点，进行引物设计，从而获得一系列SSR引物；4)、建兰SSR引物的扩增与筛选:利用步骤3)得到的建兰SSR引物对多个建兰品种的基因组进行PCR扩增；供试样的基因组采取CTAB法进行提取，然后PCR扩增，最后制备聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，恒压电泳直至指示剂到达底部，对凝胶进行银染显影，并用扫描仪器进行拍照、记录结果，最后用DNAladder估算扩增产物的分子量；5)建兰SSR引物通用性检测：检验建兰中成功扩增的SSR引物的转移性(通用性)，以其他兰属植物的基因组为模板，检测所述引物在其他兰属植物中的扩增情况，根据扩增结果，筛选多态的SSR引物。所述的步骤1)以及步骤2)采用Trinity进行序列拼接和开发阅读框分析，步骤2)中采用MSATCOMMANDER进行SSR检索。步骤3)中所述的进化选择压力小的SSR位点是指位于非开放阅读框区的SSR位点，或者在开放阅读框的三和六核苷酸SSR位点。步骤3)中，所述的引物设计挑选在非开放阅读框区的SSR位点，或者在开放阅读框的三和六核苷酸SSR位点，同时挑选重复基元多的SSR，采用引物设计软件Primer3.0进行引物设计。进一步，根据步骤5)所述的多态的SSR引物和现有物种信息，模拟出兰属多个物种的群体，设定最小个体准确归入率(min％Assigntopopulation)和分配严谨度(AssignmentstringencyLOD)的基础上计算每个标记分辨分数(score或％RelativeScore)，即在兰属中各个物种间的分辨能力，然后进行最优组合，建立兰属植物核心指纹标记库。所述的兰属植物分子标记包含SSR01-SSR49共49对标记，每对标记包括2个引物序列，分别如SEQIDNO:01-SEQIDNO:98所示。一种兰属植物核心指纹标记库，它包含SSR02、SSR07、SSR08、SSR32和SSR49共5对标记，每对标记包括2个引物序列，分别如SEQIDNO:03-SEQIDNO:04、SEQIDNO:13-SEQIDNO:14、SEQIDNO:15-SEQIDNO:16、SEQIDNO:63-SEQIDNO:64、SEQIDNO:97-SEQIDNO:98所示，用于兰属植物的物种区分。一种兰属植物鉴定的试剂盒，它包括扩增或测序的引物试剂，所述的引物试剂至少包括SSR02、SSR07、SSR08、SSR32、SSR49共5对标记，每对标记包括2个引物序列，分别如SEQIDNO:03-SEQIDNO:04、SEQIDNO:13-SEQIDNO:14、SEQIDNO:15-SEQIDNO:16、SEQIDNO:63-SEQIDNO:64、SEQIDNO:97-SEQIDNO:98所示。所述的引物包括进行标记修饰、突变或者添附后的引物。本专利技术的有益效果：第一、信息量大。该标记的多态性不仅仅代表着标记等位基因的多态，还意味着所在基因表达或编码的多样性。第二、通用性好。由于转录本保守性较高，故具有较好的通用性。以此开发的分子标记适用于兰属植物的遗传多样性、亲缘性以及遗传作图等多方面的研究。第三、建立一个兰属植物核心指纹标记库，其包括两方面内容：第一、指纹库标记集合种间分辨率的保证；第二、指纹库标记数量的控制。因为高物种区分度的分子标记数量影响着兰属物种鉴定的精确性，而数量少的指纹库标记能有效提高检测效率。附图说明图1是标记SSR32对48兰属材料进行PCR扩增后电泳图的结果。其中1-48为表1中的供试材料，M为DNAladder。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步的详细描述。实施例1兰属SSR标记的制备及筛选方法本实施例为兰属SSR标记的制备及筛选方法，主要包括以下步骤:1、建兰基因表达序列的获得:选取建兰的花苞提取总RNA，采用标准的Solexa测序方法，获得转录组Reads，去除低质量、载体和非编码序列(例如rRNA、tRNA和miRNA)，利用Trinity拼接软件完成序列拼接，最终获得101423建兰的非冗余Unigene序列。2、建兰转录组序列中SSR位点的检索:利用MSATCOMMANDER分析SSR的发生频率。最小的重复基元数分别设置为单核苷酸10次、双核苷酸6次、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸分别为4次，一共发现了7936个SSRs。Trinity用于分析拼接以后的Unigene的开发阅读框(ORF)，然后根据这些开发阅读框来确认SSR的位置。3、建兰SSR位点的筛选和引物设计:根据SSR的位置和重复基元数的数量，对含有SSR位点进行选择，挑选那些在编码区的三和六核苷酸重复，在非编码区选择二、四和五核苷酸重复，同时尽可能选择重复基元多的SSR，另外结合SSR侧翼区域序列，应用Primer3.0软件进行引物设计，引物设计的主要参数包括:GC含量45-65％,Tm值50-65℃，引物长度18–25bp，预期扩增产物长度100bp以上，由此随机选取80对引物进行合成。4、建兰基因组提取以及SSR的扩增与筛选:选取12个建兰品种用于检测建兰SSR引物的扩增性。每份材料选取幼嫩叶片约50-100mg置于2.0ml离心管中，并置入直径为0.5cm的钢珠，液氮本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种兰属微卫星标记的建立方法，其特征在于，步骤是：1)、建兰转录组序列的获得:选取建兰的花苞，提取总RNA，得到转录组序列片段（Reads），去除干扰信息后，完成序列拼接，获得建兰的转录组非冗余序列（Unigene）； 2)、建兰转录组非冗余序列中微卫星标记（SSR）位点的鉴定:采用SSR检索软件对Unigene进行SSR位点查找，从而获得一系列SSR位点，同时，分析Unigene的开放阅读框，然后根据这些开放阅读框来进一步确认SSR的位置；3)、建兰SSR引物的设计:选取进化选择压力小的SSR位点，进行引物设计，从而获得一系列SSR引物；4)、建兰SSR引物的扩增与筛选:利用步骤3）得到的建兰SSR引物对多个建兰品种的基因组进行PCR扩增；供试样的基因组采取CTAB法进行提取，然后PCR扩增，最后制备聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，恒压电泳直至指示剂到达底部，对凝胶进行银染显影，并用扫描仪器进行拍照、记录结果，最后用DNA ladder估算扩增产物的分子量；5）建兰SSR引物通用性检测：检验建兰中成功扩增的SSR引物的转移性（通用性），以其他兰属植物的基因组为模板，检测所述引物在其他兰属植物中的扩增情况，根据扩增结果，筛选多态的SSR引物。...

【技术特征摘要】
1.一种兰属植物核心指纹标记库，其特征在于，由SSR02、SSR07、SSR08、SSR32和SSR49共5个标记组成，每个标记包括2个引物序列，分别如SEQIDNO:03-SEQIDNO:04、SEQIDNO:13-SEQIDNO:14、SEQIDNO:15-SEQIDNO:16、SEQIDNO:63-SEQIDNO:64、SEQIDNO:97-SEQIDNO:98所示，用于兰属植物的物种区分。2.一种兰属...

【专利技术属性】
技术研发人员：李小白，金亮，向林，秦德辉，金凤，孙崇波，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33