一种结肠小袋纤毛虫的体外培养方法技术

本发明专利技术公开了一种结肠小袋纤毛虫的体外培养方法，步骤如下：1）虫体接种：将含有结肠小袋纤毛虫的污染物接种于RSS培养基，在28℃条件下培养48h；2）培养基配制：按照新生牛血清15-25%，pH值6.0-8.0的199培养基75～85%的体积分数配制培养基，每3mL培养基中加入20～40mg淀粉；3）虫体培养：a）在步骤2）形成的培养基中加入青霉素和链霉素各1万U/mL；b）将结肠小袋纤毛虫悬液接种于步骤a）形成的培养基上，28℃条件下培养96～108h，得到最高种群密度为接种密度42.75～74.5倍的结肠小袋纤毛虫。本发明专利技术的结肠小袋纤毛虫的体外培养方法，具有配制方法简单、操作方便、稳定性较好、种群密度高的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种结肠小袋纤毛虫的体外培养方法，属于动物寄生虫病学以及原生动物体外培养

技术介绍
结肠小袋纤毛虫（Balantidium coli）是一种寄生于肠道的原虫，目前已知是感染人类以及非人灵长类动物的最大原虫（Solaymani-Mohammadi S,Petri WA Jr.Zoonotic implications of swine-transmitted protozoal infections.Vet Parasitol2006,140:189–203）。结肠小袋纤毛虫病（Balantidiosis）呈世界性分布，主要流行于热带和亚热带地区。人的结肠小袋纤毛虫病是通过污染的水源、媒介昆虫、卫生条件(包括个人和环境)以及与猪密切接触等途径而获得感染。免疫抑制病人如艾滋病人、白血病人感染机率高于正常人群；精神病院及收容所人群感染率高于其它人群。人感染结肠小袋纤毛虫病后在临床上可表现为腹痛、腹泻、里急后重等症状。有些病例还可表现为尿生殖道感染，对人体健康危害较大（Schuster F L,Ramiyez-Avila L.Current world status of Balantidium coli.Clinical Microbiology Reviews,2008，21：626–638.）。1971年5～6月间，卡若林岛国（西太平洋）的Truk岛曾暴发人结肠小袋纤毛虫病，主要是台风破坏了家园和屋顶的雨水收集系统，>使人们没有了无污染的水源。人们只能使用被猪和人的粪便污染的泉水和井水，从而导致110个岛上居民感染结肠小袋纤毛虫病(蒋金书.动物原虫病学，2000，7：329-333)。结肠小袋纤毛虫可以感染30多种动物，其中猪的感染最为普遍，感染率在20%～100%。已发现结肠小袋纤毛虫能够与猪瘟、圆环病毒、蓝耳病毒及沙门氏菌等混合感染，常加剧病情，造成患病猪死亡率上升，增加了治疗难度。因此，建立一种结肠小袋纤毛虫的体外培养方法，加强结肠小袋纤毛虫的生物学特性方面的研究非常重要。目前用于结肠小袋纤毛虫体外培养的培养基如LE、Robinson’s、TYSGM-9、Balamuth’s、Jones’s等培养基存在配制繁琐、稳定性较差等问题(Clark,C.G.,and L.S.Diamond.Methods for cultivation of luminal parasitic protists of clinical importance.Clin.Microbiol.Rev.2002,15:329–341.)。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种结肠小袋纤毛虫的体外培养方法。为了实现以上目的，本专利技术所采用的技术方案是提供一种结肠小袋纤毛虫的体外培养方法，步骤如下：1）虫体接种：将含有结肠小袋纤毛虫的污染物接种于RSS培养基，在28℃条件下培养48h；2）培养基配制：按照新生牛血清15-25%，pH值6.0-8.0的199培养基75～85%的体积分数配制培养基，每3mL培养基中加入20～40mg淀粉，混合均匀；3）虫体培养：a）在步骤2）形成的培养基中按照各1万U/mL的比例加入青霉素和链霉素；b）按照每3mL培养基接种100μL结肠小袋纤毛虫悬液的比例，将结肠小袋纤毛虫悬液分别接种于步骤a）形成的培养基上，28℃条件下培养96～108h，得到最高种群密度为接种密度42.75～74.5倍的结肠小袋纤毛虫。所述的RSS培养基配方为：新生牛血清20%～25%，pH值7.0的洛克氏液75%～80%，每3mL培养基加消毒米粉20mg～30mg，每1mL培养基加入青霉素和链霉素各1万U。所述的洛克氏液组成为：氯化钠8g，氯化钾0.2g，氯化钙0.2g，氯化镁0.01g，磷酸氢二钠2g，磷酸二氢钾0.3g，蒸馏水1000mL。具体配制时，将除氯化钙、氯化镁之外的其它试剂加入到997mL蒸馏水中，之后配制10％的氯化钙溶液和1％的氯化镁溶液，三种溶液分别进行高压灭菌。临用前，取2mL的10％的氯化钙溶液和1mL的1％氯化镁溶液加入到其它试剂配成的997mL溶液中。体外培养结肠小袋纤毛虫的最佳培养基配比为新生牛血清25%，pH7.0的199培养基75%，每3mL培养基添加30mg淀粉。本专利技术的结肠小袋纤毛虫的体外培养方法，是以199培养基为基础，辅以淀粉和新生牛血清建立的，具有配制方法简单、操作方便、稳定性较好的优点。本专利技术体外培养的结肠小袋纤毛虫的最高种群密度可达接种密度的74.5倍。具体实施方式结肠小袋纤毛虫虫体采自洛阳市某猪场含有结肠小袋纤毛虫病猪粪便。RSS培养基：新生牛血清20%～25%，pH值7.0的洛克氏液75%～80%，每3mL培养基加消毒米粉20mg～30mg，每1mL培养基加入青霉素和链霉素各1万U。洛克氏液(Ringer液)组成为：氯化钠8g，氯化钾0.2g，氯化钙0.2g，氯化镁0.01g，磷酸氢二钠2g，磷酸二氢钾0.3g，蒸馏水1000mL。具体配制时，将除氯化钙、氯化镁之外的其它试剂加入到997mL蒸馏水中，之后配制10％的氯化钙溶液和1％的氯化镁溶液，三种溶液分别进行高压灭菌。临用前，取2mL的10％的氯化钙溶液和1mL的1％氯化镁溶液加入到其它试剂配成的997mL溶液中。199培养基购自美国Invitrogen生命技术有限公司。实施例本实施例提供结肠小袋纤毛虫的体外培养方法，步骤如下：1、虫体接种：将含有结肠小袋纤毛虫病猪粪便接种于RSS培养基，在28℃条件下培养48h。2、培养基配制：选影响虫体繁殖的消毒淀粉量、新生牛血清比例和199培养液初始pH值三个因素进行试验，每个因素选三个水平，利用L9(34)正交表，分析上述三个因素对结肠小袋纤毛虫在培养体系中最高种群密度的影响，确定最佳培养基组成，具体试验方案见表1。每个试验组设计两个平行样品，进行有重复观测值正交试验。3、虫体培养：1）在培养基中按照青霉素和链霉素各1万U/mL的比例加入青霉素和链霉素；2）按照每3mL培养基接种结肠小袋纤毛虫悬液100μL的比例，将结肠小袋纤毛虫悬液分别接种于试验号1-9的培养基上，每个培养基2个平行试样，28℃条件下培养，每12h检查一次，直至样品种群密度连续两次下降为止。观察时，将培养基与结肠小袋纤毛虫充分混匀，吸取40μL滴于载玻上，加盖玻片，于100倍镜暗视野下计数30个视野活虫数。表1正交试验方案以每一种培养基内虫体最高种群密度为基本数据，利用有本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结肠小袋纤毛虫的体外培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1）虫体接种：将含有结肠小袋纤毛虫的污染物接种于RSS培养基，在28℃条件下培养48h；2）培养基配制：按照新生牛血清15‑25%，pH值6.0‑8.0的199培养基75～85%的体积分数配制培养基，每3mL培养基中加入20～40mg淀粉，混合均匀；3）虫体培养：a）在步骤2）形成的培养基中按照各1万U/mL的比例加入青霉素和链霉素；b）按照每3mL培养基接种100μL结肠小袋纤毛虫悬液的比例，将结肠小袋纤毛虫悬液分别接种于步骤a）形成的培养基上，28℃条件下培养96～108h，得到最高种群密度为接种密度42.75～74.5倍的结肠小袋纤毛虫。

【技术特征摘要】
1.一种结肠小袋纤毛虫的体外培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）虫体接种：
将含有结肠小袋纤毛虫的污染物接种于RSS培养基，在28℃条件下培养48h；
2）培养基配制：
按照新生牛血清15-25%，pH值6.0-8.0的199培养基75～85%的体积分数配制培养基，
每3mL培养基中加入20～40mg淀粉，混合均匀；
3）虫体培养：
a）在步骤2）形成的培养基中按照各1万U/mL的比例加入青霉素和链霉素；
b）按照每3mL培养基接种100μL结肠小袋纤毛虫悬液的比例，将结肠小袋纤毛虫悬液
分别接种于步骤a）形成的培养基上，28℃条件下培养96～108h，得到最高种群密度为接种密
度42.75～74.5倍的结肠小袋纤毛虫。
2.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：王天奇，闫文朝，钱伟锋，丁轲，韩利方，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：河南;41