一次复合PCR反应鉴定大麻植物化学型的方法技术

本发明专利技术公开了一种一次复合PCR反应鉴定大麻植物化学型的方法，该方法包括以下步骤：1)大麻植物基因组DNA提取；2)复合PCR引物设计：3)PCR反应体系配置；4)PCR扩增；5)琼脂糖电泳；6)PCR产物电泳条带观察及化学型判断。通过一次复合PCR反应，毒品型大麻可以扩增出约550bp大小的特异性THC条带，纤维型大麻可以扩增出约1050bp大小的特异性CBD条带，而中间型大麻可以同时扩增出上述550bp和1050bp大小的两条条带，通过扩增条带情况，可直观地判断出应试大麻样品的化学型分离。该方法不受传统化学检测中取样时间、取样部位等约束，具有操作简单、周期短、成本低廉等特点，能够对大麻植株化学型进行快速鉴定，可供公安毒品检测部门、农业育种部门等使用，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学
，涉及一种一次复合PCR反应鉴定大麻植物化学型的方法。 
技术介绍
大麻(Cannabis sativaL.)是大麻科(Cannabinaceae)大麻属(Cannabis)一年生草本植物，多为雌雄异株。世界各地都有广泛的栽培或野生，现主要分布在亚洲和欧洲，我国大麻种质资源丰富，为我国传统经济作物，有着悠久的栽培历史。大麻是一种公认的双面性植物，一方面大麻有着重要的经济价值，涉及纺织、造纸、食品、建材、化工及制药等多个方面，为人类社会发展作出了巨大贡献。另一方面由于大麻植株中含有一种致幻成瘾的活性成分——四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol,THC)，大麻在西方社会被滥用为毒品，是一种公认的毒品原植物。如何正确处理大麻植物利用与毒品滥用之间的矛盾，已经成为全世界关注的焦点。 大麻素是大麻植物中特有的含有烷基和单萜基团分子结构的一类次生代谢产物。目前，已从大麻干物质及新鲜大麻叶中分离出大麻素70多种，但是以THC和大麻二酚(cannabidiol,CBD)的含量最高，约占大麻植株中大麻素的90％，THC和CBD为大麻素中两个主要物质。根据THC和CBD两者含量比值大小，可将大麻植物分为毒品型、中间型和纤维型三种，其中纤维型大麻中不含或含极微量THC，无毒品利用价值，可开发成工业大麻并合理利用(陈璇，2011；ELSOHLY，2005)。目前公安禁毒部门以及农业科研部门进行大麻植物检测过程中，只能使用化学方法来检测大麻植株中THC或CBD含量，由于大麻植物在不同生长时期、不同部位中THC或CBD等含量差异很大(大麻素作为植物次生代谢产物，其含量还受到环境因子的影响)，以雌性植株始果期的顶部花叶中含量最高，所以检测部位需为大麻雌性植株始果期的顶部花叶(云南省地方标准，2009；伍菊仙，2010)。化学检测方法对取样时间、取样部位、取样量及材料处理过程均较苛刻，步骤复杂，检测费用昂贵。 研究表明，THC和CBD在新鲜大麻植株中都是以酸的形式存在(即THCA和CBDA，脱羧基则变成酚的形式)，且THCA和CBDA是由同一个前体物质——大麻萜酚酸(CBGA)， 经过不同氧化还原酶(THCA合成酶、CBDA合成酶)催化而得到，两者之间互为同源异构体。本专利技术正是基于用分子生物学手段来区分这两个相似性很高的同源异构体，经大量的科学实验而得到。经查阅，尚未见有使用复合PCR方法来鉴定大麻化学型的专利及文献报道。 
技术实现思路
为了克服现有技术中存在的缺陷，本专利技术提供一种一次复合PCR反应鉴定大麻植物化学型的方法，不受生长环境、取样时间、取样部位及取样量的影响，可一次性鉴定出大麻化学型(毒品型、中间型或纤维型)，高效而准确。其技术方案如下： 一种一次复合PCR反应鉴定大麻植物化学型的方法，包括以下步骤： 1)大麻植物基因组DNA提取：采用植物常规CTAB法来提取大麻基因组DNA，提取对象为大麻植物生长任何生长时期、任何生长部位，优选取样对象为植株的幼嫩组织(幼嫩根、茎、叶等)，取样量一般大于0.1g即可，提取的基因组DNA用RNase A水溶液溶解并放置37℃下消化RNA，测定DNA溶液浓度和质量后，用于后续PCR反应中的模板； 2)复合PCR引物设计：合成三条特异性引物，序列分别为： A引物5′-AGTTGGCTTGCAGATTCGAACTCG-3′， B引物5′-GGAAAAATTGAAGAGAAGTAACCA-3′， C引物5′-GCCTTGCTTCTCCCAACTACATA-3′； 3)PCR反应体系配置：总体积25μL，引物A为0.5μL、B为1.0μL、C为1.0μL(引物母液浓度均为10μmol/L)，dNTP为2.0μL(母液浓度为10mmol/L)，模板DNA为20～100ng，TaqDNA聚合酶为1.0U，Buffer(含Mg2+)为2.5μL，其余用去离子水补齐； 4)PCR扩增：将配置好的PCR体系放到PCR仪器中运行，运行条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，59℃退火45s，72℃延伸90s，35个循环；72℃延伸7min； 5)PCR产物琼脂糖电泳：PCR反应结束后，取反应液3～8μL在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳条件为：恒电压80～120V电泳20min；琼脂糖胶的第一个孔或最后一个孔用来点DNAMarker，根据Markert条带大小对比判断PCR产物大小。 6)PCR产物观察及化学型判断：将电泳结束后的凝胶在紫外仪下观察，当材料为 毒品型大麻时，只能观察到由AB引物特异扩增出的大小约550bp的标记条带；当材料为纤维型时，只能观察到由AC引物特异扩增出的大小约1050bp的标记条带，而当材料为中间型时，则能同时观察到上述550bp和1050bp大小的两个标记。 与现有技术相比，本专利技术的有益效果： 1)本专利技术具有操作简单、周期短、成本低廉等优点。不受植株生长环境、取样时间和取样部位的影响，通过常规的分子生物学实验手段即可一次性鉴定出大麻化学型。 2)本专利技术适合对我国不同来源地区的大麻种质资源进行化学型鉴定，可作为工业大麻新品种选育过程中低毒大麻材料筛选的技术方法。 附图说明图1是48份大麻资源复合PCR扩增情况，S1～S48为48份材料编号；M为DNA分子Marker(Trans2K PlusⅡDNA Marker)。 具体实施方式下面结合具体实施例进一步说明本专利技术的技术方案。 一次复合PCR反应鉴定我国不同来源地大麻资源化学型的方法，包括以下步骤： 1)大麻植物基因组DNA提取：研究材料为我国不同地理来源地的大麻资源，以种子种植的方式统一种植在云南省昆明市。采用植物常规CTAB法来提取大麻基因组DNA，提取对象为大麻植株快速生长期的幼嫩叶样组织。取0.5g叶样用液氮或机器研磨，采用常规2×CTAB提取方法，提取的DNA晾干后用12.5μg/ml的RNaseA水溶液溶解，并于37℃下水浴1h。DNA溶液经0.8％琼脂糖电泳及分光光度计检测浓度和质量后，用去离子水稀释到浓度为50ng/L，-20℃保存备用。 2)复合PCR引物设计：合成三条引物，引物合成量均为2OD。按照引物合成说明，用去离子水将引物稀释到10μmol/L，-20℃保存备用。序列分别为： A引物5′-AGTTGGCTTGCAGATTCGAACTCG-3′， B引物5′-GGAAAAATTGAAGAGAAGTAACCA-3′， C引物5′-GCCTTGCTTCTCCCAACTACATA-3′； 3)PCR反应体系配置：总体积25μL，引物A为0.5μL、B为1.0μL、C为1.0μL，引物母液均为10μmol/L；dNTP为2.0μL，母液为10mmol/L；模板DNA为1μL(50ng)；TaqDNA聚合酶为1.0U；Buffer(含Mg2+)为2.5μL，其余用去离子水补齐；PCR薄壁管及相关试本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种一次复合PCR反应鉴定大麻植物化学型的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)大麻植物基因组DNA提取：采用植物常规CTAB法来提取大麻基因组DNA，提取对象可以为大麻任何生长环境下的任何生长时期、任何组织，提取的基因组DNA用于后续PCR反应中的模板；2)复合PCR引物设计：合成三条引物，序列分别为：A引物5′‑AGTTGGCTTGCAGATTCGAACTCG‑3′，B引物5′‑GGAAAAATTGAAGAGAAGTAACCA‑3′，C引物5′‑GCCTTGCTTCTCCCAACTACATA‑3′；3)PCR反应体系配置：总体积25μL，引物A为0.5μL、B为1.0μL、C为1.0μL，引物母液均为10μmol/L；dNTP为2.0μL，母液为10mmol/L；模板DNA为20～100ng，TaqDNA聚合酶为1.0U，含Mg2+的Buffer为2.5μL，其余用去离子水补齐；4)PCR扩增：将配置好的PCR体系放到PCR仪器中运行，运行条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，59℃退火45s，72℃延伸90s，35个循环；72℃延伸7min；5)琼脂糖电泳：PCR反应结束后，取反应液3～8μL在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳条件为：恒电压80～120V电泳20min；6)PCR产物观察及化学型判断：将电泳结束后的凝胶在紫外成像仪下观察，当材料为毒品型大麻时，AB引物可特异扩增出大小约550bp的标记条带；当材料为纤维型时，AC引物可特异扩增出大小约1050bp的标记条带；而当材料为中间型时，可同时扩增出约550bp和1050bp大小的两个标记。...

【技术特征摘要】
1.一种一次复合PCR反应鉴定大麻植物化学型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)大麻植物基因组DNA提取：采用植物常规CTAB法来提取大麻基因组DNA，
提取对象可以为大麻任何生长环境下的任何生长时期、任何组织，提取的基因组DNA
用于后续PCR反应中的模板；
2)复合PCR引物设计：合成三条引物，序列分别为：
A引物5′-AGTTGGCTTGCAGATTCGAACTCG-3′，
B引物5′-GGAAAAATTGAAGAGAAGTAACCA-3′，
C引物5′-GCCTTGCTTCTCCCAACTACATA-3′；
3)PCR反应体系配置：总体积25μL，引物A为0.5μL、B为1.0μL、C为1.0μL，
引物母液均为10μmol/L；dNTP为2.0μL，母液为10mmol/L；模板DNA为20～100ng，
TaqDNA聚合酶为1.0U，含Mg2+的Buffe...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈璇，郭鸿彦，杨明，郭孟璧，张庆滢，许艳萍，郭蓉，陈裕，
申请(专利权)人：云南省农业科学院经济作物研究所，
类型：发明
国别省市：云南;53