用于rs8099917单核苷酸多态性的直接荧光PCR检测试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于rs8099917单核苷酸多态性的直接荧光PCR检测试剂盒及应用，所述试剂盒包括检测PCR试剂、阳性对照PCR试剂和阴性对照PCR试剂，所述检测PCR试剂包括单核苷酸多态性rs8099917位点的特异性引物1和引物2、探针1和PCR Mixture1；本发明专利技术将人口腔拭子样本或人外周血样本直接作为模板，加入优化的PCR反应体系中进行检测，过程一步完成，无需开盖，既能减少实验操作步骤，节省时间，同时还避免了开盖操作可能带来的样本污染。

【技术实现步骤摘要】
(一)
本专利技术涉及一种单核苷酸多态性检测的试剂盒，具体涉及一种用于rs8099917位点单核苷酸多态性直接荧光PCR检测的试剂盒及其检测方法。(二)
技术介绍
rs8099917位点是白介素-28B(interleukin-28B，IL-28B)单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点，研究发现该位点的C或T等位基因多态性与丙型肝炎病毒(HCV)感染后病毒清除能力和疾病进展高度相关。丙型病毒性肝炎是一种由HCV感染引起的病毒性肝炎，据世界卫生组织统计，全球HCV的感染率约为3％，呈全球性流行。IL-28B基因型是基因1型慢性HCV感染采用PEG-IFN联合RBV或蛋白酶抑制剂三联方案治疗前重要的预测指标。联合PEG-IFN和RBV治疗后获得SVR及HCV感染自发清除的可能性取决于IL-28B附近核苷酸序列和19号染色体上的IFNγ的基因片段。其中IL-28B基因rs8099917位点单核苷酸多态性与HCV感染后病毒清除能力和疾病进展高度相关，研究发现rs8099917GG型患者对病毒治疗无效。绝大多数疾病的发生与环境因素和遗传因素的综合作用有关，通常认为是在个体具有遗传易感性的基础上，环境有害因素作用而导致疾病。不同群体和个体对疾病的易感性、抵抗性以及其他生物学性状(如对药物的反应性等)有差别，其遗传学基础是人类基因组DNA序列的变异性，其>中最常见的是SNP。SNP主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。SNP在人类基因组中广泛存在，某些SNP直接影响蛋白的结构表达及遗传稳定性等。随着人类基因组计划的进展，人们愈来愈相信基因组中的SNP有助于解释个体的表型差异、不同群体和个体对疾病，特别是对复杂疾病的易感性以及对各种药物的耐受性和对环境因子的反应。因此，寻找和研究SNP已成为人类基因组计划的内容和目标之一。通过对IL-28B rs8099917位点单核苷酸多态性的检测，可筛选出治疗效果好的人群，果断进行抗病毒治疗，对治疗预期无效患者，建议更改或等待更好治疗方案，从而实现对丙型肝炎抗病毒个体化治疗指导；检测国际公认的丙肝治疗相关的关键性SNP位点rs8099917，不仅可指导传统的IFN+RBV丙肝治疗，还可用于最新的蛋白酶抑制剂类药物治疗丙肝的指导。临床针对SNP位点常用的检测方法有DNA直接测序、荧光PCR等，DNA直接测序操作繁琐费时且敏感度低，而荧光PCR技术因其灵敏度高、特异性强、操作简便等特点在多种医学检测领域得到广泛应用。目前已经在临床上应用的荧光PCR检测试剂和方法多达上千种，常规通过荧光PCR检测核酸的方法一般需要两个独立的过程：一是核酸模板制备，二是将核酸模板加入反应体系中进行PCR扩增检测。一般核酸模板制备过程基本一致，都需要经过消化裂解、吸附纯化、洗涤收集等步骤。单个样本的处理往往耗时数十分钟，对大量样本进行处理时，耗时甚至比PCR检测反应更长。由于繁多的操作步骤，在大样本处理过程中，样本之间的相互污染也不可避免。直接荧光PCR技术采用优化的PCR缓冲液体系和特殊的DNA聚合酶，减少样本中存在的多种抑制剂对PCR反应的干扰，具有强活力、高稳定性、强耐受性等特点。该技术无需进行昂贵又费时的核酸抽提过程，使用人标本或病原体保存液即可直接用于PCR扩增鉴定，极大的缩短了检测时间和简化操作步骤。本专利技术针对IL-28B基因rs8099917位点多态性序列设计特异性引物探针，采用ARMS引物增敏结合Taqman探针和优化的PCR反应体系的直接荧光PCR技术，提供一种直接荧光聚合酶链反应(荧光PCR)定性检测rs8099917位点单核苷酸多态性的试剂盒，缩短PCR检测时间和简化操作步骤，低成本快速检测rs8099917位点多态性，能够明确样本中核酸片段rs8099917位点基因多态性。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种用于rs8099917位点单核苷酸多态性检测的直接荧光PCR检测试剂盒，明确样本中核酸片段rs8099917位点基因多态性，本专利技术采用直接荧光PCR技术作为检测方法，直接以样本做模板进行检测，缩短PCR检测时间和简化操作步骤。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种rs8099917位点单核苷酸多态性检测的试剂盒，所述试剂盒包括检测PCR试剂、阳性对照PCR试剂和阴性对照PCR试剂，所述检测PCR试剂包括单核苷酸多态性rs8099917位点的特异性引物1和引物2、探针1和PCR Mixture1；所述阳性对照PCR试剂包括阳性质控品、引物3、引物4、TaqMan探针2和PCR Mixture2，所述阳性质控品为rs8099917位点野生型和突变型质粒混合液；所述阴性对照PCR试剂包括阴性质控品、引物5、引物6、TaqMan探针3和PCR Mixture3，所述阴性质控品为rs8099917位点野生型质粒溶液；所述PCR Mixture1包括PCR缓冲液、dNTPs、BSA、MgCl2、Taq 22B DNA聚合酶和双蒸水，所述PCR Mixture2和PCR Mixture3的组成同PCR Mixture1；引物1、引物3和引物5均为：5’-ACATACAACATGGAGAGTTAAAG-3'(seq1)；引物2和引物6均为：5’-TGGTTCCAATTTGGGTGgC-3'(seq3)；引物4为：5’-TGGTTCCAATTTGGGTGgA-3'(seq2)；TaqMan探针1、TaqMan探针2和TaqMan探针3均为：5’-FAM-AAGTCTTGTATTTCACCTCCTGGAGG-BHQl-3’(seq4)；野生型质粒的序列为(seq5)：GTTCCTTGTAAAAGATTCCATCCATACAAAAACATACAACATGGAGAGTTAAAGTAAGTCTTGTATTTCACCTCCTGGAGGTAAATATTTTTTAACAATTTGTCACTGTTCCTCCTTTTGTTTTCCTTTCTGTGAGCAATTTCACCCAAATTGGAACCATGCTGTATACAGTTTGGTAGCTGGCTTTTTATGTCTTACCATTATCTCTCATTTGCATTCTCCCACATCTTTAATTATAGCGTATCAGTTAGGGCC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于rs8099917单核苷酸多态性的直接荧光PCR检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括检测PCR试剂、阳性对照PCR试剂和阴性对照PCR试剂，所述检测PCR试剂包括单核苷酸多态性rs8099917位点的特异性引物1和引物2、探针1和PCR Mixture1；所述阳性对照PCR试剂包括阳性质控品、引物3、引物4、TaqMan探针2和PCR Mixture2，所述阳性质控品为rs8099917位点野生型和突变型质粒混合液；所述阴性对照PCR试剂包括阴性质控品、引物5、引物6、TaqMan探针3和PCR Mixture3，所述阴性质控品为rs8099917位点野生型质粒溶液；所述PCR Mixture1包括PCR缓冲液、dNTPs、BSA、MgCl2、Taq 22B DNA聚合酶和双蒸水，所述PCR Mixture2和PCR Mixture3的组成同PCR Mixture1；引物1、引物3和引物5均为：5’‑ACATACAACATGGAGAGTTAAAG‑3'；引物2和引物6均为：5’‑TGGTTCCAATTTGGGTGgC‑3'；引物4为：5’‑TGGTTCCAATTTGGGTGgA‑3'；TaqMan探针1、TaqMan探针2和TaqMan探针3均为：5’‑FAM‑AAGTCTTGTATTTCACCTCCTGGAGG‑BHQl‑3’；野生型质粒的序列为：GTTCCTTGTAAAAGATTCCATCCATACAAAAACATACAACATGGAGAGTTAAAGTAAGTCTTGTATTTCACCTCCTGGAGGTAAATATTTTTTAACAATTTGTCACTGTTCCTCCTTTTGTTTTCCTTTCTGTGAGCAATTTCACCCAAATTGGAACCATGCTGTATACAGTTTGGTAGCTGGCTTTTTATGTCTTACCATTATCTCTCATTTGCATTCTCCCACATCTTTAATTATAGCGTATCAGTTAGGGCCCAGCAGGAAACAGATGGCCCGTCAATTTAGGATAATTTGAGGTGGGGTTGATACCAGAAGCCTTTA；突变型质粒的序列为：GTTCCTTGTAAAAGATTCCATCCATACAAAAACATACAACATGGAGAGTTAAAGTAAGTCTTGTATTTCACCTCCTGGAGGTAAATATTTTTTAACAATT TGTCACTGTTCCTCCTTTTGTTTTCCTTTCTGTGAGCAATGTCACCCAAATTGGAACCATGCTGTATACAGTTTGGTAGCTGGCTTTTTATGTCTTACCATTATCTCTCATTTGCATTCTCCCACATCTTTAATTATAGCGTATCAGTTAGGGCCCAGCAGGAAACAGATGGCCCGTCAATTTAGGATAATTTGAGGTGGGGTTGATACCAGAAGCCTTTA。...

【技术特征摘要】
1.一种用于rs8099917单核苷酸多态性的直接荧光PCR检测试剂盒，其
特征在于所述试剂盒包括检测PCR试剂、阳性对照PCR试剂和阴性对照PCR
试剂，所述检测PCR试剂包括单核苷酸多态性rs8099917位点的特异性引物
1和引物2、探针1和PCR Mixture1；所述阳性对照PCR试剂包括阳性质控
品、引物3、引物4、TaqMan探针2和PCR Mixture2，所述阳性质控品为
rs8099917位点野生型和突变型质粒混合液；所述阴性对照PCR试剂包括阴
性质控品、引物5、引物6、TaqMan探针3和PCR Mixture3，所述阴性质控
品为rs8099917位点野生型质粒溶液；所述PCR Mixture1包括PCR缓冲液、
dNTPs、BSA、MgCl2、Taq 22B DNA聚合酶和双蒸水，所述PCR Mixture2
和PCR Mixture3的组成同PCR Mixture1；
引物1、引物3和引物5均为：5’-ACATACAACATGGAGAGTTAAAG-3'；
引物2和引物6均为：5’-TGGTTCCAATTTGGGTGgC-3'；
引物4为：5’-TGGTTCCAATTTGGGTGgA-3'；
TaqMan探针1、TaqMan探针2和TaqMan探针3均为：
5’-FAM-AAGTCTTGTATTTCACCTCCTGGAGG-BHQl-3’；
野生型质粒的序列为：
GTTCCTTGTAAAAGATTCCATCCATACAAAAACATACAACATGGAGAGTTAAAGTAAGTCTTGT
ATTTCACCTCCTGGAGGTAAATATTTTTTAACAATT
TGTCACTGTTCCTCCTTTTGTTTTCCTTTCTGTGAGCAATTTCACCCAAATTGGAACCATGCTGTA
TACAGTTTGGTAGCTGGCTTTTTATGTCTTACCATTATCTCTCATTTGCATTCTCCCACATCTTTAA
TTATAGCGTATCAGTTAGGGCCCAGCAGGAAACAGATGGCCCGTCAATTTAGGATAAT
TTGAGGTGGGGTTGATACCAGAAGCCTTTA；
突变型质粒的序列为：
GTTCCTTGTAAAAGATTCCATCCATACAAAAACATACAACATGGAGAGTTAAAGTAAGTCTTGT
ATTTCACCTCCTGGAGGTAAATATTTTTTAACAATT TGTCACTGTT
CCTCCTTTTGTTTTCCTTTCTGTGAGCAATG
TCACCCAAATTGGAACCATGCTGTATACAGTTTGGTAGCTGGCTTTTTATGTCTTACCATTATCTCTC
ATTTGCATTCTCCCACATCTTTAATTATAGCGTATCAGTTAGGGCCCAGCAGGAAACAGATGGCCC
GTCAATTTAGGATAATTTGAGGTGGGGTTGATACCAGAAGCCTTTA。
2.如权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹亦菲，郭兴中，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33