本发明专利技术公开了一种重组酰胺酶Dt‑Ami 2、编码基因、载体、工程菌及应用，本发明专利技术提供了一种来源于代尔夫特菌Delftia tsuruhatensis CCTCC No.M 205115的酰胺酶基因及其编码的重组酰胺酶WB；该酰胺酶基因可与表达载体连接构建得到含该基因的胞内表达重组质粒，转化至大肠杆菌菌株中，获得重组大肠杆菌，该重组大肠杆菌含有重组酰胺酶，可以利用重组酰胺酶为催化剂催化系列酰胺化合物的水解。
【技术实现步骤摘要】
(一)
本专利技术涉及一种酰胺酶及应用，特别涉及一种重组酰胺酶Dt-Ami 2、编码基因、含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及该酰胺酶或含有该酶的重组细胞为催化剂在在催化一系列酰胺中的应用。 (二)
技术介绍
酰胺酶(Amidase,EC 3.5.1.4)能够催化酰胺C-N键水解生成相应的羧酸和氨。当反应体系中存在比水更强的酰基受体如羟胺或肼时，则生成相应的氧肟酸和酰肼。酰胺酶底物范围广，对α位含手性中心的底物具有优良的立体选择性，在制备羧酸和酰胺衍生物等手性化合物中具有巨大应用潜力。酰胺酶已成功用于多个手性药物中间体如(S)-哌嗪-2-甲酸(US5945534)，(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸(US7553652)和(S)-2,2-二甲基环丙甲酰胺(ZL200510061680)的工业化生产。 根据氨基酸序列特征，酰胺酶可分为酰胺酶标签家族(Amidase Signature Family,AS)和腈水解酶家族(Nitrilase Family，NF)两大类。AS家族酰胺酶的氨基酸序列含有130个左右高度保守氨基酸区域，并含有催化三联体Lys-Ser-Ser，作用底物范围较广，可水解脂肪族、芳香族及杂环类酰胺，如来自Stenotrophomonas maltophilia和Rattus norvegicus的酰胺酶。NF家族酰胺酶同源性很高，并含有Lys-Ser-Glu催化三联体，通常水解脂肪族酰胺，如来自Pseudomonas aeruginosa，Bacillus stearothermophilu和Rhodococcus erythropolis酰胺酶。 生物催化剂的多样性是生物催化反应多样性的前提和基础。但是，目前已报道的酰胺酶十分有限，这极大限制了酰胺酶在生物合成中的应用。因此，挖掘和筛选底物谱广、立体选择性严格的酰胺酶具有十分重要的意义。 (三)
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种来源于代尔夫特菌Delftia tsuruhatensis ZJB-05174的酰胺酶Dt-Ami 2基因及其重组酰胺酶Dt-Ami 2，以及含有该基因的重组表达载体，重组表达转化体，该重组酶Dt-Ami 2的制备方法及该酰胺酶Dt-Ami 2的应用。 本专利技术采用的技术方案是： 本专利技术涉及一种来源于代尔夫特菌(Delftia tsuruhatensis)ZJB-05174的重组酰胺酶Dt-Ami 2，所述酰胺酶Dt-Ami 2的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。 本专利技术所述酰胺酶Dt-Ami 2通过基因挖掘的方法获得，所设计的挖掘方法具体为根据AS家族及NF家族酰胺酶保守序列，有针对性地寻找NCBI收录的基因编码的氨基酸序列，进一步筛选可匹配催化三联体的蛋白。选定一批预测的酰胺酶，将所选的酰胺酶进行克隆表达，构建重组大肠杆菌细胞。通过本实验室专利技术的方法(ZL200510062182)进行酰胺酶活力的筛选，最终获得催化性能较佳的重组酰胺酶Dt-Ami 2。 本专利技术所述重组酰胺酶Dt-Ami 2来源于代尔夫特菌(Delftia tsuruhatensis)ZJB-05174，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M 205115，保藏日期为2005年10月10日，已在先前的专利申请(申请号为CN 200510061680)中披露。 由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ NO：2所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在95％以上，均属于本专利技术保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非 保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。 本专利技术提供一种所述重组酰胺酶Dt-Ami 2在水解酰胺制备羧酸中的应用，所述的应用为：将含重组酰胺酶Dt-Ami 2基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体用pH 8.0 Tris-HCl缓冲液(优选Tris-HCl缓冲液(20 mM咪唑，pH 8.0))悬浮后进行超声破碎，取上清液提取纯酶作为催化剂，以式(Ⅰ)所示化合物、式(Ⅱ)所示化合物、2,2-二甲基环丙甲酰胺、色氨酰胺或2-氨基-4-甲硫基丁酰胺为底物，以pH 6～9的Tris-HCl缓冲液作为反应介质构成反应体系，在25～45℃下进行水解反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得羧酸产物； 式(Ⅰ)中R1为C1～C4烷基，R2为氢、羟基或甲基；式(Ⅱ)中R3为苯基、苄基、对羟基苄基或苯乙基。优选，所述式(Ⅰ)所示化合物(脂肪族酰胺类)优选为丙酰胺，正丁酰胺，异丁酰胺，戊酰胺，己酰胺，(S)-乳酰胺或(R)-乳酰胺；式(Ⅱ)所示化合物(芳香族酰胺)优选为苯甲酰胺，苯乙酰胺，4-羟基苯乙酰胺或苯丙酰胺。 所述催化剂的用量以破碎前湿菌体重量计为0.08～8 g/L反应体系，所述底物初始浓度为20 mmol/L反应体系。 本专利技术所述催化剂按如下方法制备：(1)将含重组酰胺酶Dt-Ami 2编码基因的工程菌(优选工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-dt-ami 2)接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37 ℃培养过夜，再以1％(v/v)接种量接种到含终浓度50μg/mL卡那霉素LB液体培养基中，37 ℃，150 rpm培养至菌体浓度OD600至0.6左右，加入终浓度为0.1 mM的IPTG，28 ℃诱导培养12 h后，4 ℃、8000 rpm离心10 min，收集湿菌体；(2)将含重组酰胺酶Dt-Ami 2编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体用pH 8.0 Tris-HCl缓冲液悬浮后进行超声破碎(350 W，15min)，将破碎混合液离心，取上清液进行Ni-NTA柱层析，以洗脱缓冲液洗脱，收集目标蛋白，将收集的目标蛋白在20 mM，pH 8.0的Tris-HCl中透析过夜，取透过液即获得催化剂；所述洗脱缓冲液为含终浓度500mM咪唑和终浓度500 mM NaCl的20 mM、pH 8.0 Tris-HCl的缓冲液。 进一步，上清液提取纯酶的方法为：以Ni-NTA柱为纯化柱，装柱体积为20 mL，先用平衡缓冲液(20 mM Tris-HCl，500 mM NaCl和20 mM咪唑，pH 8.0)平衡Ni-NTA柱，以1.5 mL/min的速率上样上清液，用平衡缓冲液洗脱以除去未吸附的蛋白，最后用洗脱缓冲液(20 mM Tris-HCl，500 mM NaCl和500 mM咪唑，pH 8.0)洗脱收集目标蛋白，收集的目标蛋白在20 mM，pH 8.0的Tris-HCl中透析过夜(更换2次缓冲液)，透过液即为纯酶。 本专利技术还涉及一种编码所述重组酰胺酶Dt-Ami 2的基因，优选所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。 本专利技术所述重组酰胺酶Dt-Ami 2本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种来源于代尔夫特菌(Delftia tsuruhatensis)ZJB‑05174的重组酰胺酶Dt‑Ami 2，其特征在于所述酰胺酶Dt‑Ami 2的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种来源于代尔夫特菌(Delftia tsuruhatensis)ZJB-05174的重组酰胺
酶Dt-Ami 2，其特征在于所述酰胺酶Dt-Ami 2的氨基酸序列为SEQ ID NO.2
所示。
2.一种权利要求1所述重组酰胺酶Dt-Ami 2在水解酰胺制备羧酸中的
应用，其特征在于所述的应用为：将含重组酰胺酶Dt-Ami 2基因的工程菌经
发酵培养获得的湿菌体用pH 8.0 Tris-HCl缓冲液悬浮后进行超声破碎，取上
清液提取纯酶作为催化剂，以式(Ⅰ)所示化合物、式(Ⅱ)所示化合物、
2,2-二甲基环丙甲酰胺、色氨酰胺或2-氨基-4-甲硫基丁酰胺为底物，以pH 6～9
的Tris-HCl缓冲液为反应介质构成反应体系，在25～45℃下进行水解反应，
反应结束后，将反应液分离纯化，获得羧酸产物；
式(Ⅰ)中R1为C1～C4烷基，R2为氢、羟基或甲基；式(Ⅱ)中R3为
苯基、苄基、对羟基苄基或苯乙基。
3.如权利要求2所述应用，其特征在于所述催化剂的用量以破碎前湿菌
体重量计为0.08～8 g/L反应体系，所述底物初始浓度为20 mmol/L反应体系。
4.如权利要求2所述应用，其特征在于所述底物为丙酰胺、正丁酰胺、
异丁酰胺、戊酰胺、己酰胺、(S)-乳酰胺、(R)-乳酰胺、苯甲酰胺、苯乙
酰胺、4-羟基苯乙酰胺、苯丙酰胺、2,2-二甲基环丙...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑裕国，吴哲明，郑仁朝，沈寅初，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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