一种包含表达功能性重组人凝血因子Ⅶ载体的宿主细胞及其高水平表达方法技术

一种包含表达功能性重组人凝血因子Ⅶ载体的宿主细胞及其高水平表达方法，目的是构建含FⅦ、GGCX及VKORC1重组核酸的表达载体，利用GGCX及VKORC1的协同表达提高重组FⅦ的g-羧基化修饰；本发明专利技术宿主细胞包含编码维生素K依赖的人凝血因子Ⅶ（FⅦ）重组核酸、小鼠维生素K还原酶复合体亚基1（VKORC1）重组核酸和小鼠g氨基酸羧化酶（GGCX）重组核酸，以及绝缘子insulator（4X）重组核酸；高水平表达功能性人凝血因子Ⅶ的方法包括构建一种表达载体，利用脂质体法将该表达载体介导进入DHFR缺陷型CHO动物细胞内，DMEM培养基筛选阳性克隆；无血清驯化培养该宿主细胞株；利用镍离子亲和层析纯化hFⅦ重组蛋白，SDS-PAGE及Westernblot检测；凝血酶原时间(PT)测定FⅦ重组蛋白促凝血活性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及包含一种表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含：编码维生素K依赖的人凝血因子Ⅶ（FⅦ）重组核酸、小鼠维生素K还原酶复合体亚基1（VKORC1）重组核酸和小鼠g氨基酸羧化酶（GGCX）重组核酸，以及绝缘子insulator（4X）重组核酸。其中小鼠维生素K还原酶复合体亚基1（VKORC1）和小鼠g氨基酸羧化酶（GGCX），及人凝血因子Ⅶ（FⅦ）在所述的宿主细胞中均获得稳定表达。本专利技术同时还涉及一种可高水平表达功能性人凝血因子Ⅶ的方法，该宿主细胞在特定条件和规模下培养可显著提高功能性人凝血因子Ⅶ的产率。
技术介绍
凝血因子Ⅶ(coagulation factor Ⅶ, FⅦ)是一种维生素K依赖的单链糖蛋白，主要由肝脏合成，是凝血块形成起始的关键分子之一，在凝血过程中发挥着极其重要的作用。FⅦ主要通过与组织因子（tissue facter, TF）结合，形成TF-FⅦ复合物，从而启动外源凝血途径，并对内源性凝血途径具有特殊的调控作用。人FⅦ在血浆中主要以酶原形式存在，当FⅦ的Arg152-Ile153之间的肽链裂解后，由单链形式转变为双链形式，形成活性FⅦa。FⅦa由含153个氨基酸、分子量为20 kDa的轻链，含254个氨基酸、分子量为30 kDa的重链，通过原135位和262位氨基酸之间形成的二硫键连接。临床研究表明, FⅦ对血小板减少症和血小板功能障碍、严重创伤、大面积外科手术的止血具有令人满意的治疗效果。而目前药用FⅦ的主要来源为血浆提取，但血浆中FⅦ含量很低，仅有200-400 mg/ml，难以满足临床需要；同时血浆提取制备工艺复杂，批间差异较大、稳定性较差；而且以血浆作为原料，大大增加了外源病毒的感染风险。血浆提取制备FⅦ，由于含量有限、工艺复杂、感染风险等原因而受到限制，基因重组制备FⅦ成为开发和研究的重点，而基因工程技术的发展也为FⅦ的体外重组制备提供了可能。FⅦ的凝血活性功能需要复杂的翻译后加工，包括谷氨酸的g-羧基化、天冬氨酸的β-羟基化、N-糖基化、O-糖基化等，因此必须利用具有复杂的蛋白后加工的真核表达系统来完成。目前已有包括酵母表达系统和哺乳动物细胞表达系统的多种FⅦ重组制备策略被公开(参见CN101376875A, CN102321668A, CN101906438A )，在一定程度上实现了FⅦ的重组表达。然而其中具有g-羧基谷氨酸区修饰的功能性重组蛋白却含量甚少，成为阻碍其进一步开发利用的瓶颈。g-羧基谷氨酸区（也称“Gla”区）的翻译后修饰，是FⅦ保持凝血活性的关键。而Gla修饰，是g氨基酸羧化酶（GGCX）在还原型维生素K辅酶作用下的结果(de Visser MC, Roshani S, Rutten JW, van Hylckama Vlieg A, Vos HL, Rosendaal FR, Reitsma PH., 2011. Haplotypes of VKORC1, NQO1 and GGCX, their effect on activity levels of vitamin K-dependent coagulation factors, and the risk of venous thrombosis.Thromb Haemost.106(3):563-565.)。在Gla修饰中，还原型维生素K被GGCX氧化形成维生素K环氧化物，然后维生素K环氧化物又被还原酶复合体亚基1（VKORC1）再循环为还原型维生素K参与羧基化修饰。因此，GGCX和VKORC1是FⅦ进行谷氨酸g-羧基化、保证凝血活性的关键酶蛋白。然而研究发现，细胞培养基中外源维生素K的添加，无法提高FⅦ的表达水平（参见CN101124320A）；FⅦ与VKORC1的共表达对其表达水平的提高也贡献有限（参见CN101124320A）；且与GGCX的协同表达，也难以实现功能性FⅦ的有效释放（参见CN101124320A）。因此，VKORC1作用下还原型维生素K的供应形式，是该反应的限速步骤；GGCX和 VKORC1的协同作用是活性FⅦ稳定高水平表达的关键。已有报道通过FⅦ、GGCX及VKORC1的共表达在一定程度上提升提高了功能性FⅦ的表达水平（参见CN101198696A）。然而由于不同启动子之间的启动强度差异，以及外源基因片段过大，共表达基因之间的相互影响，导致功能性FⅦ的整体生产率依然较低。绝缘体是一类独特的染色质调控元件，可通过阻止异染色质扩散，降低共表达单元相互影响，维持被保护基因的持续表达，从而有效提高目的基因的表达水平（参见CN101285072A）。通过插入绝缘子基因单元提高外源基因的转录和合成水平，是目前活性蛋白质制备的一种有效策略。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服上述已有技术的不足，通过基因重组技术，构建含FⅦ、GGCX及VKORC1重组核酸的表达载体，利用GGCX及VKORC1的协同表达提高重组FⅦ的g-羧基化修饰，同时引入绝缘子insulator（4X）重组核酸，通过脂质体转染和亚克隆筛选提供一种包含表达功能性重组人凝血因子Ⅶ载体的宿主细胞；同时利用氨甲喋呤(amethopterin, MTX)梯度加压筛选及金属亲和层析，提供一种可高水平表达功能性人凝血因子Ⅶ的方法。本专利技术第一方面，提供了一种包含表达功能性重组人凝血因子Ⅶ载体的宿主细胞，其特征在于包含：编码维生素K依赖的人凝血因子Ⅶ（FⅦ）重组核酸、小鼠维生素K还原酶复合体亚基1（VKORC1）重组核酸和小鼠g氨基酸羧化酶（GGCX）重组核酸，以及绝缘子insulator（4X）重组核酸；其中FⅦ、VKORC1和GGCX在宿主细胞中均获得稳定表达。其中，编码维生素K依赖的FⅦ重组核酸和二氢叶酸还原酶（DHFR）重组核酸通过内部核糖体进入位点（IRES）连接，利用CAG启动子（CMV early enhancericken beta actin promoter，由AG promoter和hCMV-IE enhancer组成）启动；编码VKORC1重组核酸和GGCX重组核酸同样通过IRES连接，CAG启动子启动；且两个启动子组成的重组核酸表达单元通过绝缘子insulator（4X）重组核酸隔离。所述宿主细胞为DHFR缺陷型CHO哺乳细胞。所述的绝缘子insulator（4X）由经部分改造的鸡HS4绝缘体单元4倍串联而成；经改造的鸡HS4绝缘体重组核酸其核苷酸序列为SEQ ID NO:1；绝缘子insulator（4X）插入位置为两个启动子组成的重组核酸表达单元的下游；所述编码维生素K依赖的人凝血因子Ⅶ（FⅦ）重组核酸其核苷酸序列为SEQ ID NO:2；所述编码小鼠维生素K还原酶复合体亚基1（VKORC1）重组核酸其核苷酸序列为SEQ ID NO:3；所述编码小鼠g氨基酸羧化酶（GGCX）重组核酸其核苷酸序列为SEQ ID NO:4；所述表达功能性重组人凝血因子Ⅶ载体从上游到下游依次包含以下表达元件：1）第一启动子，所述启动子选自CAG promoter（CMV early enhancer本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含表达功能性重组人凝血因子Ⅶ载体的宿主细胞，其特征在于包含编码维生素K依赖的人凝血因子Ⅶ（FⅦ）重组核酸、小鼠维生素K还原酶复合体亚基1（VKORC1）重组核酸和小鼠g氨基酸羧化酶（GGCX）重组核酸，以及绝缘子insulator（4X）重组核酸；其中FⅦ、VKORC1和GGCX在宿主细胞中均获得稳定表达。

【技术特征摘要】
1.一种包含表达功能性重组人凝血因子Ⅶ载体的宿主细胞，其特征在于包含编码维生素K依赖的人凝血因子Ⅶ（FⅦ）重组核酸、小鼠维生素K还原酶复合体亚基1（VKORC1）重组核酸和小鼠g氨基酸羧化酶（GGCX）重组核酸，以及绝缘子insulator（4X）重组核酸；其中FⅦ、VKORC1和GGCX在宿主细胞中均获得稳定表达。
2.如权利要求1所述的包含表达功能性重组人凝血因子Ⅶ载体的宿主细胞，其特征在于编码维生素K依赖的hFⅦ重组核酸和二氢叶酸还原酶（DHFR）重组核酸通过内部核糖体进入位点（IRES）连接，利用CAG启动子（CMV early enhancericken beta actin promoter，由AG promoter和hCMV-IE enhancer组成）启动；编码VKORC1重组核酸和GGCX重组核酸同样通过IRES连接，CAG启动子启动；且两个启动子组成的重组核酸表达单元通过绝缘子insulator（4X）重组核酸隔离。
3.如权利要求1和2所述的包含表达功能性重组人凝血因子Ⅶ载体的宿主细胞，其特征在于所述的绝缘子insulator（4X）重组核酸由经部分改造的鸡HS4绝缘体单元4倍串联而成；经部分改造的鸡HS4绝缘体单元其核苷酸序列为SEQ ID NO:1；绝缘子insulator（4X）重组核苷酸插入位置为两个启动子组成的重组核酸表达单元的下游。
4.如权利要求1和2所述的包含表达功能...

【专利技术属性】
技术研发人员：张全爱，赵邑，张禄卿，郑耀武，何永吉，潘薇薇，赵峰梅，梁雅丽，曹鹏程，赵亚蕊，
申请(专利权)人：太原博奥特生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山西;14