一种抗乙型肝炎病毒x蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种抗乙型肝炎病毒x蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒，所述检测试剂盒包括：1)重组乙型肝炎病毒X蛋白；2)HBx蛋白抗体阴、阳性对照品；3)酶标记结合物；4)显色底物；以及5)浓缩洗涤液。本发明专利技术的试剂盒检测灵敏度高，检测耗时短，有助于尽早地诊断肝癌患者，及时治疗，提高生存率。并且，与仅检测AFP标志物相比，在检测AFP标志物的同时采用本发明专利技术的试剂盒检测HBx蛋白抗体可显著提高肝癌的诊断敏感性。

【技术实现步骤摘要】
一种抗乙型肝炎病毒X蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒及其 制备方法
本专利技术涉及生物技术和免疫学领域，具体涉及检测肝癌标志物乙型肝炎病毒X蛋 白（HBx)抗体的试剂盒。
技术介绍
人体我国每年约有11?13万人死于原发性肝癌，占全球肝癌死亡数的半数之多。 近年来，通过提高肝癌早期诊断率、改进肝癌切除方法和实施肝移植等手段，我国部分肝癌 高发地区的死亡率有所下降，但是肝癌总体的发病率仍然呈上升趋势。 目前，影像学诊断、细胞与组织学诊断及化学诊断是肿瘤诊断的三大主要方法。影 像学诊断在肝癌诊断中起重要的作用，但是在诊断小肝癌及区分良恶性结节中均具有一 定的局限。超声检查或CT阳性结果，结合血清甲胎蛋白（a-fetoprotein，AFP)水平高于 400ng/ml的检测结果，可对肝癌做出确诊。但是，通常当这些条件都符合时，己经错过了治 疗的最佳时机。无论是超声波检查、CT扫描还是核磁共振，对小病灶的鉴定都有一定的局 限性，尤其是肝硬化结节在影象学上与小肝癌结节有许多的相似之处。因此，虽然影像学技 术在今年来取得了巨大的进步，但临床上仍需结合肝癌的分子标志物，在较为复杂的病例 中将良恶性肝病进行区分。 目前肝癌诊断最常用的标志物是甲胎蛋白（AFP)，在症状和影像学改变发生前数 月即可出现异常。正常人血清中AFP含量一般小于10ng/ml。当AFP的诊断值定为20ng/ ml时，其敏感性为50 % -60 %，但在肿瘤较小的病例中，敏感性显著降低，有报道仅为40 %。 单独使用AFP作为肝癌诊断标志物的另一个问题是缺乏特异性，在相当多的慢性肝炎患者 尤其是肝硬化患者中，AFP含量也达20-200ng/ml。目前认为可与AFP互补诊断的标志物有 AFP异质体、Y -谷氨酞转移酶同工酶II和异常凝血酶原等，但由于它们在敏感性和特异性 上的不足，以及检测方法的繁琐复杂，使其始终停留在实验室研究水平，未能转化成临床常 规检查项目。因此，探索新的肿瘤分子标志物，以及建立相应的易于推广的检测方法，仍是 当今肝癌研究领域的重要课题之一。 随着对HBV和原发性肝癌研究的深入，人们发现HBV中的X基因表达产物（HBx) 在肝癌形成过程中起着关键的作用。在诱发肝细胞癌的众多因素中，乙型肝炎病毒感染占 到50%以上。最新的研究显示，HBx具有广泛的基因转录调控作用，与慢性HBV感染者发展 成为HCC密切相关。X基因位于HBV基因组的1374-1836位置，编码155个氨基酸的多肽， 即HBx。X基因常随HBV基因组一同整合于肝细胞的染色体中，利用宿主细胞转录和翻译 体系合成HBx。HBx具有广泛的基因转录调控作用，不仅能够激活病毒基因调控序列，而且 能够与宿主细胞多种蛋白相互作用，从而影响宿主细胞周期、影响细胞增殖分化与凋亡、使 肝细胞发生恶性转化。HBx可与转录因子XPA-1、DDB1、RPB5和TFIIB结合，以提高基因转 录水平、抑制DNA的修复、促进病毒自身复制；HBx还具有反式激活作用，可上调多种细胞因 子及其受体，如血管内皮生长因子（VEGF)、胰岛素样生长因子（IGF)及其受体的表达；激活 C-myt、N-ras等癌基因，与抑癌基因 p53结合，抑制P53的核转移及正常的转录调节功能。 此外，HBx还可上调Η印G-2的细胞端粒酶活性，改变抑癌基因 p55负调控功能，抑制细胞凋 亡，四细胞发生恶性转化，与HCC的发生密切相关。近几年国外研究显示，在HBV感染后约 60%肝癌患者血清中可检测到HBx抗体。血清HBx抗体水平可能成为一种新型的肝癌标志 物。 目前，免疫分析技术在乙型肝炎病毒X蛋白抗体免疫分析产品的应用方面仍未 见。因此，本领域迫切需要开发可灵敏检测乙型肝炎病毒X蛋白抗体的检测系统及检测方 法，为临床肿瘤的诊断提供良好的途径。
技术实现思路
本专利技术提供了一种能够简便、快速、灵敏、稳定地检测乙型肝炎病毒X蛋白抗体的 试剂盒，该试剂盒适于在产业上有效地推广应用。 本专利技术提供了一种抗乙型肝炎病毒x(HBx)蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒及其制 备方法。 该抗乙型肝炎病毒X蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒包括：1)重组乙型肝炎病毒X 蛋白；2)抗乙型肝炎病毒X蛋白抗体阴、阳性对照品；3)酶标记结合物；4)显色底物；5)浓 缩洗漆液。 在本专利技术中，重组乙型肝炎病毒X蛋白包含至少一个乙型肝炎病毒X蛋白的抗原 表位，以便结合于抗乙型肝炎病毒X蛋白的抗体。该重组乙型肝炎病毒X蛋白可进一步含 有乙型肝炎病毒X蛋白的全长或部分氨基酸序列，以增加特异性免疫反应。并且各个该乙 型肝炎病毒X蛋白的抗原表位之间、各个该乙型肝炎病毒X蛋白的部分氨基酸序列之间以 及乙型肝炎病毒X蛋白的抗原决定位与乙型肝炎病毒X蛋白的部分氨基酸序列之间可进 一步由连接片段连接。在本专利技术的一个实施例中，重组乙型肝炎病毒X蛋白序列如SEQ ID No. 1所示。 理想的固相载体应与重组乙型肝炎病毒X蛋白有较高的结合容量，且结合稳定极 少脱落；并且其可结合抗原或抗体免疫反应物，以及如亲和素或链霉亲和素等大分子蛋白 质；重组乙型肝炎病毒X蛋白固相化后仍应保持活性，而且为有利于反应充分进行，最好其 活性基团朝向反应溶液；此外，固相化方法应简便易行、快速经济。在本专利技术中，固相载体 可以采用塑料制品，使得重组乙型肝炎病毒X蛋白可通过非共价或物理吸附机制结合到固 相载体表面，比如：聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板。固相载体也可以采用微颗 粒，此类固相载体系由高分子单体聚合成的微球或颗粒，其直径多为微米（μ m)，由于带有 能与蛋白质结合功能团（如一 NH2、一 C00H、一 0H、一 CH0或一 NH - NH2等），易与抗体（抗 原）形成化学偶联，且结合容量大。并且，固相载体还可以采用膜载体，包括硝酸纤维素膜 (nitrocellulose, NC)玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。优选地，在本专利技术的一个实施 例中，包被所述重组乙型肝炎病毒X蛋白的固相载体为微孔板。 在本专利技术中，酶标记结合物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。酶标记 结合物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。优选地，酶 标记结合物为酶标记抗体，其将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。更优选地，酶标记结 合物为辣根过氧化物酶（HRP)、碱性磷酸酶（AP)、葡萄糖氧化酶、β -半乳糖苷酶、溶菌酶和 苹果酸脱氢酶等。进一步优选地，酶标记结合物为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的检 测抗体。 在本专利技术中，显色底物可以是易于配制、保存且产生的信号产物易于观察和检测 并且对人无害且价廉、易得等特点的任何显色底物。优选地，显色底物为邻苯二胺（0PD)、四 甲基联苯胺（TMB)和对硝基苯磷酸酯（p-NPP)。更优选地，显色底物为3, 3'，5, 5' -四甲基 联苯胺。 在本专利技术中，还提供了抗乙型肝炎病毒X (HBx)蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒在 检测抗乙型肝炎病毒X蛋白抗体中的应用。 在本专利技术中，又提供了抗乙型肝炎病毒X (HBx)蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒在 制备用于肝癌诊断的试剂盒中的应用。 此本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗乙型肝炎病毒x蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒，包括：1)重组乙型肝炎病毒x蛋白；2)抗乙型肝炎病毒x蛋白抗体阴、阳性对照品；3)酶标记结合物；4)显色底物；5)浓缩洗涤液。

【技术特征摘要】
1. 一种抗乙型肝炎病毒X蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒，包括： 1) 重组乙型肝炎病毒X蛋白； 2) 抗乙型肝炎病毒X蛋白抗体阴、阳性对照品； 3) 酶标记结合物； 4) 显色底物； 5) 浓缩洗涤液。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述重组乙型肝炎病毒X蛋白序列如SEQ ID No. 1 所示。3. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，包被所述重组乙型肝炎病毒X蛋白的固相 载体为微孔板。4. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标记结合物为辣根过氧化物酶或 碱性磷酸酶标记的检测抗体。5. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述显色底物为3, 3'，5, 5' -四甲基联苯 胺。6. 权利要求1-5任一项所述的试剂盒在检测抗乙型肝炎病毒X蛋白抗体中的应用。7. 权利要求1-5任一项所述的试剂盒在制备用于肝癌诊断的试剂盒中的应用。8. -种制备权利要求1-5所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 通过原核载体表达重组乙型肝炎病毒X蛋白； 2) 制备包被所述重组乙型肝炎病毒X蛋白的固相载体； 3) 以抗乙型肝炎病毒X蛋白抗体阴、阳性血清制备对照品； 4) 以酶标记检测抗体； 5) 配制显色底物； 6) 配制浓缩洗涤液； 7) 分装所述抗乙型肝炎病毒X蛋白抗体阴、阳性对照品、酶标记结合、显色底物及浓缩 洗涤液； 8) 组装为成品。9. 如权利要求8所述的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓东，叶丽虹，
申请(专利权)人：天津托普法玛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12