一种羧酸酯酶基因dsRNA及其在防治麦长管蚜中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种羧酸酯酶基因dsRNA及其在防治麦长管蚜中的应用。本发明专利技术所提供的dsRNA，为由序列表中序列1所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA。实验证明，饲喂羧酸酯酶基因dsRNA后，麦长管蚜羧酸酯酶基因有不同程度的降低，说明麦长管蚜通过口针摄入的dsRNA进入了麦长管蚜的细胞内发生了RNAi级联反应，目的基因的表达受到了干扰。在形态学角度来看，麦长管蚜的生长状态均发生了变化，饲喂羧酸酯酶基因dsRNA的麦长管蚜的蜕皮指数比对照显著降低。这表明羧酸酯酶基因dsRNA可以用于麦长管蚜的防治，本发明专利技术为下一步利用植物介导的RNAi技术创建小麦新种质奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种羧酸酯酶基因dsRNA及其在防治麦长管蚜中的应用
本专利技术属于生物
，涉及一种羧酸酯酶基因dsRNA及其在防治麦长管蚜中的应用。
技术介绍
小麦是我国的主要粮食作物。小麦田内害虫种类很多，主要害虫有地下害虫、小麦吸浆虫、麦蚜、麦蜘蛛、食叶的粘虫等,其中麦蚜对小麦的危害最为严重。麦蚜属同翅目蚜科，俗称腻虫、由汗、蜜虫等，是我国小麦上的主要害虫之一。其种类主要包括麦长管蚜(Sitobionavenae)、麦二叉蚜(Schizaphisgraminum)、禾谷缢管蚜(RhopalosiphumpadiLinnaeus)、麦无网长管蚜(Acyrthosiphondirhodum)等。麦长管蚜、麦二叉蚜和禾谷缢管蚜在世界各个地区广泛分布，我国小麦种植区内均有发生。麦二叉蚜主要分布在西北、华北地区，麦长管蚜危害南北麦区，禾谷缢管蚜在南方地区发生严重。麦蚜的发生受气候影响较大，在小麦生不同的生长期内，麦蚜的危害优势种有所不同，在小麦拔节期，麦二叉蚜种群密度大，到达抽穗期，麦长管蚜逐渐变为优势种，麦二叉蚜与麦长管蚜混合发生，小麦抽穗以后，禾谷缢管蚜发生严重。麦蚜以若蚜、成蚜聚集在小麦叶片、茎干，吸食小麦汁液，造成小麦叶片出现黄斑或枯萎，在苗期危害严重时造成小麦苗枯死，后期危害穗部，造成小麦籽粒干瘪，使小麦品质变劣，产量降低。麦蚜排出的废物覆盖在叶片上使叶片变黑，光合作用受到严重影响。此外，麦蚜还分泌毒素，传播病害，严重影响小麦产量和品质。因麦蚜的危害造成小麦减产一般在10％-20％，麦蚜危害严重时小麦减产量达到30％。麦蚜还可以传播小麦与大麦黄矮病毒，使小麦产量降低。RNAi的基本过程包括起始阶段和效应阶段。在起始阶段，dsRNA穿过细胞膜进入细胞后，细胞质中的一种RNA酶Ⅲ家族的内切酶Dicer酶特异识别dsRNA，Dicer酶将dsRNA切割成许多21bp-23bp的小片段(smallinterferenceRNA，siRNA)，每个siRNA都有2个突出的核苷酸。效应阶段，siRNA与一个酶复合物形成一种沉默复合物(RNA-indueedsileneeingeomplex，RISC)。在ATP存在的前提下，携带的双链siRNA被RISC变成单链siRNA分子，变成具有活性的RISC(Slicer)。之后Slicer与外源性基因表达的mRNA分子结合，RISC在结合部位开始切割mRNA。切割后的mRNA诱导细胞降解这些mRNA片段。siRNA还能引导目的RNA结合RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase,RdRP)，合成新的dsRNA，然后由Dicer酶切割产生新的siRNA，又引发新一轮的合成切割过程，沉默信号逐渐扩大。目前常用的dsRNA导入的方法有注射法、浸泡法、饲喂法、组织培养法、植物介导法等。注射法是通过显微注射仪将dsRNA导入到昆虫体内，是目前最常用的方法。这种方法既有优点又有缺点，优点是效率高，缺点是体外合成保存dsRNA成本高，难以避免注射的伤口影响昆虫生长。浸泡法是用dsRNA溶液浸泡昆虫组织或细胞，可以有效地抑制基因表达。浸泡法有一定的局限性，只适合于昆虫一定的发育阶段和易吸收dsRNA的细胞组织，在研究中应用较少。饲喂法操作方便且简单，对昆虫的影响小。喂食dsRNA在许多昆虫中都取得了成功，例如半翅目、鳞翅目、鞘翅目昆虫。组织培养法将dsRNA混入培养基，昆虫细胞从培养基里吸收dsRNA。目前利用这种方法取得成功的昆虫有果蝇、埃及伊蚊、白纹伊蚊。这种方法要求的培养基条件严格，不容易培养得到符合要求的细胞，对这种方法的使用受一定限制。转基因植物介导法是借助植物持续不断的产生稳定的dsRNA，昆虫持续取食这种植物会不断的摄入dsRNA。但是这种方法也有一定的局限性，不同昆虫或同一昆虫的不同基因对通过口腔进入的RNAi的敏感性不同，影响喂食dsRNA的成功率的关键因素是昆虫的上皮细胞摄入dsRNA的效率。Walshe等发现利用喂食方法可以抑制刺舌蝇(Glossinamorsitansmorsitans)中肠表达TsetseEP，却不能抑制脂肪体的传递蛋白基因2A192的表达。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种羧酸酯酶基因(CarE基因)dsRNA及其在防治麦长管蚜中的应用。本专利技术所提供的dsRNA，具体为由序列表中序列1所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA。编码所述dsRNA的DNA分子也属于本专利技术的保护范围。所述DNA分子的核苷酸序列具体为序列表中序列2。含有所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因系细胞系也属于本专利技术的保护范围。所述dsRNA、或所述DNA分子、或所述表达盒、重组载体、重组菌或转基因系细胞系，在如下(a1)-(a4)任一中的应用也属于本专利技术的保护范围：(a1)防治麦长管蚜或制备防治麦长管蚜的产品；(a2)抑制麦长管蚜生长或制备抑制麦长管蚜生长的产品；(a3)降低麦长管蚜蜕皮指数或制备降低麦长管蚜蜕皮指数的产品；(a4)抑制麦长管蚜羧酸酯酶基因表达或制备抑制麦长管蚜羧酸酯酶基因表达的产品。进一步，所述应用为将所述dsRNA导入麦长管蚜，从而实现防治麦长管蚜、抑制麦长管蚜生长、降低麦长管蚜蜕皮指数或抑制麦长管蚜羧酸酯酶基因表达。在本专利技术中，所述导入的方式具体为饲喂。更加具体的，所述饲喂为：将所述dsRNA混合于液体饲料中，得到混合液；用所述混合液饲喂麦长管蚜；所述dsRNA在所述混合液中的终浓度具体为20ng/μL。所述饲喂持续的时间可为6天以上，具体如6天。在本专利技术中，所述麦长管蚜具体为4龄至成虫期的麦长管蚜，具体如4龄麦长管蚜或麦长管蚜成虫。活性成分为如下A-C中任一种的产品也属于本专利技术的保护范围：A、所述dsRNA；B、所述DNA分子；C、所述表达盒、重组载体、重组菌或转基因系细胞系；所述产品具有如下(a1)-(a4)功能中的至少一种：(a1)防治麦长管蚜；(a2)抑制麦长管蚜生长；(a3)降低麦长管蚜蜕皮指数；(a4)抑制麦长管蚜羧酸酯酶基因表达。另外，抑制麦长管蚜羧酸酯酶基因表达的物质，在如下(a1)-(a3)任一中的应用同样属于本专利技术的保护范围：(a1)防治麦长管蚜或制备防治麦长管蚜的产品；(a2)抑制麦长管蚜生长或制备抑制麦长管蚜生长的产品；(a3)降低麦长管蚜蜕皮指数或制备降低麦长管蚜蜕皮指数的产品。本专利技术将麦长管蚜CarE基因dsRNA(序列1)采用体外饲喂的方法饲喂麦长管蚜，实际上是利用RNAi技术对CarE基因的表达进行干扰。结果显示，从mRNA水平上检测饲喂后的麦长管蚜CarE基因有不同程度的降低，说明麦长管蚜通过口针摄入的dsRNA进入了麦长管蚜的细胞内发生了RNAi级联反应，目的基因的表达受到了干扰。在形态学角度来看，麦长管蚜的生长状态均发生了变化，饲喂CarE基因dsRNA的麦长管蚜的蜕皮指数比对照降低。这表明CarE基因dsRNA可以用于麦长管蚜的防治，本专利技术为下一步利用植物介导的RNAi技术创建小麦新种质奠定了基础。附图说明图1为麦长管蚜总RNA的提取结果。图2为麦长管蚜羧酸酯酶基因(CarE基因)cDNA片段的PCR扩增。M为标准DNAmarker；1为CarE基因。图本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种dsRNA，为由序列表中序列1所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA。

【技术特征摘要】
1.一种dsRNA，为由序列表中序列1所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA。2.编码权利要求1所述dsRNA的DNA分子，其核苷酸序列为序列表中序列2。3.含有权利要求2所述DNA分子的表达盒。4.含有权利要求2所述DNA分子的重组载体。5.含有权利要求2所述DNA分子的重组菌。6.权利要求1所述的dsRNA或权利要求2所述的DNA分子或权利要求3所述的表达盒或权利要求4所述的重组载体或权利要求5所述的重组菌或含有权利要求2所述DNA分子的转基因细胞系在如下(a1)-(a4)任一中的应用：(a1)防治麦长管蚜或制备防治麦长管蚜的产品；(a2)抑制麦长管蚜生长或制备抑制麦长管蚜生长的产品；(a3)降低麦长管蚜蜕皮指数或制备降低麦长管蚜蜕皮指数的产品；(a4)抑制麦长管蚜羧酸酯酶基因表达或制备抑制麦长管蚜羧酸酯酶基因表达的产品。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述应用为将权利要求1所述的dsR...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵章武，梁荣奇，邓菲，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11