组氨酸工程改造的轻链抗体和用于生成所述抗体的经基因修饰的非人动物制造技术

本申请提供了经基因修饰的非人动物，其中所述非人动物在免疫后表达能够pH依赖地与抗原结合的抗体库。本申请提供了经基因修饰的非人动物，所述动物表达来源于在非人动物的种系中的单一重排的轻链可变区基因的单一轻链可变结构域，其中所述单一重排的轻链可变区基因包含至少一个非组氨酸编码密码子被组氨酸编码密码子的取代。本申请提供了制备非人动物的方法，所述动物表达包含含有组氨酸的通用轻链的抗体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】组氨酸工程改造的轻链抗体和用于生成所述抗体的经基因修饰的非人动物相关申请的交叉引用本申请根据35U.S.C.§119(e)的规定要求2012年3月16日提交的申请号为61/611,950和2012年12月13日提交的申请号为61/736,930的美国临时专利的优先权，其均通过引用整体并入本申请。专利
本申请提供了经基因修饰的非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)，所述动物表达能够以pH依赖的方式与抗原结合的抗体。本申请提供了对非人动物的免疫球蛋白轻链可变区序列进行修饰的方法，其中所述修饰包含在所述轻链可变区基因中的残基(例如编码互补性决定区(CDR)中的一个或多个氨基酸的核苷酸)形成突变，以便于在体内表达含有轻链结构域的抗体，所述抗体显示出pH依赖的抗原结合。本申请还提供了制备pH依赖的抗原结合的抗体的方法。专利技术背景抗体通常包含同源二聚体的重链组分，其中各重链单体均与相同的轻链结合。具有异源二聚体重链组分(例如双特异性抗体)的抗体是理想的治疗性抗体。但是制备具有能够令人满意地与双特异性抗体各个重链结合的适宜的轻链组分的双特异性抗体已被证明是存在问题的。在一种方法中，可以通过测定所有轻链可变结构域使用情况的统计数据、鉴定在人源抗体中使用频率最高的轻链并在体外将该轻链与具有不同特异性的两条重链配对来选择轻链。在另一种方法中，可以通过观察噬菌体展示文库(例如含有人源轻链可变区序列的噬菌体展示文库，例如人源scFv文库)中的轻链序列并从该文库中选择最常用的轻链可变区来选择轻链。然后可以在两条不同的目标重链上对所述轻链进行检测。在另一种方法中，可以通过使用两条目标重链的重链可变序列作为探针检测轻链可变序列的噬菌体展示文库来选择轻链。可以选择与两条重链可变序列均结合的轻链作为所述重链的轻链。在另一种方法中，可以将候选轻链与所述重链的同源轻链比对，并且在所述轻链中进行修饰以使其更加紧密地匹配与两条重链的同源轻链共有的序列特征。如果需要将免疫源性的可能性最小化，则所述修饰优选地生成存在于公知的人源轻链序列中的序列，以使得基于用于评估免疫源性可能性的本领域公知的参数和方法(即计算机模拟(insilico)分析法和湿分析法)，蛋白水解加工不太可能生成T细胞表位。上述所有方法都依赖于体外方法，所述方法包含多种先验限制，例如序列一致性、与特定的预选重链的结合能力等。本领域需要某种组合物和方法，所述组合物和方法不依赖于体外条件操作、取而代之的是使用在生物学上更为明智的方法以制备包含常见轻链的人源表位结合蛋白。此外，治疗性抗体例如双特异性治疗性抗体具有一些局限性，因为其通常需要较高剂量以达到所需的疗效。这部分是由于抗体-抗原复合物被内化进入核内体(endosome)并且在称为靶介导清除的过程中被靶向到溶酶体降解。因此，本领域需要某种方法和组合物，所述方法和组合物导致更有效的抗体再循环例如双特异性抗体再循环，并通过促进在核内体隔室中抗体-抗原复合物的解离但不损害抗体与抗原的特异性和亲和性来阻止抗体降解。专利技术概述在一个方面，本专利技术提供了用于生成抗体或抗体可变结构域的生物系统，所述抗体或抗体可变结构域在中性pH下结合靶抗原但是在酸性pH下(例如pH5.0-6.0)显示出与相同抗原降低的结合。所述生物系统包含非人动物，例如啮齿动物(例如小鼠或大鼠)，所述非人动物具有包含一个或多个组氨酸修饰的重排的轻链序列(例如重排的V-J)。在各种方面，所述一个或多个组氨酸修饰在轻链CDR3密码子中。在各种方面，所述非人动物包含人源或人源化的重链免疫球蛋白基因座。在各种方面，所述非人动物包含内源性非人源重链可变基因区段被一个或多个人源重链VH、DH和JH区段取代，其中所述人源区段与非人源免疫球蛋白恒定区可操作地连接。在各种方面，本申请提供了具有通用轻链的非人动物，所述轻链含有具有非组氨酸残基被组氨酸残基取代的轻链可变结构域。在各种实施方式中，这些组氨酸修饰的通用轻链的非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠)被称为组氨酸通用轻链小鼠、组氨酸-ULC小鼠或HULC小鼠。因此，在一个方面，本申请提供了经基因修饰的非人动物，所述非人动物在其种系中含有免疫球蛋白轻链基因座，所述基因座包含含有人源VL和JL区段序列的单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列，其中所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列含有至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。在一个实施方式中，所述单一重排的人源免疫球蛋白可变区序列与免疫球蛋白轻链恒定区基因序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白轻链恒定区基因序列是非人源免疫球蛋白轻链恒定区基因序列。在一个实施方式中，所述非人源免疫球蛋白轻链恒定区基因序列是内源性免疫球蛋白轻链恒定区基因序列。在一个实施方式中，所述非人动物缺乏具有功能的未经重排的免疫球蛋白轻链可变区。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白轻链基因座在内源性非人源免疫球蛋白轻链基因座。在一个实施方式中，所述动物在其种系中还含有免疫球蛋白重链基因座，所述基因座包含未经重排的免疫球蛋白重链可变区基因序列，所述序列含有与免疫球蛋白重链恒定区基因序列可操作地连接的人源VH、DH和JH区段。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白重链恒定区基因序列是非人源重链恒定区基因序列。在一个实施方式中，所述非人源重链恒定区基因序列是内源性免疫球蛋白重链恒定区基因序列。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白重链基因座在内源性源免疫球蛋白重链基因座。在一个实施方式中，所述至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代在编码互补性决定区(CDR)的核苷酸序列中。在一个实施方式中，所述至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代在编码CDR3的核苷酸序列中。在一个实施方式中，所述取代是针对一个、两个、三个、四个或更多个CDR3密码子。在一个方面，包含在免疫球蛋白轻链基因座中的所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列来源于人源Vκ1-39或Vκ3-20基因区段。在一个实施方式中，所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区来源于重排的Vκ1-39/Jκ5或Vκ3-20/Jκ1基因区段。在一个实施方式中，所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区来源于重排的Vκ1-39/Jκ5基因序列，并且所述Vκ1-39/Jκ5基因序列包含设计为至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代以便在选自105、106、108、111及其组合的位置上表达组氨酸。在另一个实施方式中，所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区来源于重排的Vκ3-20/Jκ1基因序列，并且所述Vκ3-20/Jκ1基因序列包含设计为至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代以便在选自105、106、107、109及其组合的位置上表达组氨酸。在一个方面，本申请所述的非人动物包含对目标抗原生成应答的B细胞群，所述B细胞群富含抗体，所述抗体在酸性pH下的解离半衰期(t1/2)与在中性pH下的相比降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。在一个实施方式中，在酸性pH下t1/2与在中性pH下相比降低约30倍或更多。在一个实施方式中，所述动物表达含有人源免疫球蛋白轻链可变结构域的抗体，所述结构域在由免本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经基因修饰的非人动物，所述动物在其种系中含有免疫球蛋白轻链基因座，所述免疫球蛋白轻链基因座包含含有人源VL和JL区段序列的单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列，其中所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列含有至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.03.16 US 61/611,950;2012.12.13 US 61/736,9301.一种制备经基因修饰的啮齿动物的方法，所述方法包括修饰所述啮齿动物使其在其种系中含有免疫球蛋白轻链基因座，所述免疫球蛋白轻链基因座包含(i)含有人源VL和JL区段序列的单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列，和(ii)与所述单一重排的人源免疫球蛋白可变区序列可操作地连接的免疫球蛋白轻链恒定区基因序列，其中所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列含有至少一个遗传工程改造的插入或取代的组氨酸密码子，所述组氨酸密码子不是由相应的人源种系VL和JL基因序列编码，其中所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列编码免疫球蛋白轻链可变结构域，所述结构域在至少一个插入或取代的组氨酸密码子编码的氨基酸位置包含至少一个组氨酸残基，其中由所述免疫球蛋白轻链基因座编码的所述免疫球蛋白轻链能够与由啮齿动物选择的多条免疫球蛋白重链配对，其中当与所述免疫球蛋白轻链配对时，所述多条免疫球蛋白重链中的每个与不同表位结合。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫球蛋白轻链恒定区基因序列是非人源免疫球蛋白轻链恒定区基因序列。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述非人源免疫球蛋白轻链恒定区基因序列是内源性非人源免疫球蛋白轻链恒定区基因序列。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述啮齿动物在其种系中还含有免疫球蛋白重链基因座，所述免疫球蛋白重链基因座包含未经重排的免疫球蛋白重链可变区基因序列，所述序列含有与免疫球蛋白重链恒定区基因序列可操作地连接的人源VH、DH和JH区段，并且其中所述多条免疫球蛋白重链是由啮齿动物选择的多条人源免疫球蛋白重链，其中当与所述免疫球蛋白轻链配对时，所述多条免疫球蛋白重链中的每个与不同表位结合。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述免疫球蛋白重链恒定区基因序列是非人源免疫球蛋白重链恒定区基因序列。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述非人源重链恒定区基因序列是内源性非人源免疫球蛋白恒定区基因序列。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述啮齿动物缺乏具有功能的未经重排的免疫球蛋白轻链可变区。8.根据权利要求3所述的方法，其中所述免疫球蛋白轻链基因座在内源性非人源免疫球蛋白轻链基因座。9.根据权利要求5所述的方法，其中所述免疫球蛋白重链基因座在内源性非人源免疫球蛋白重链基因座。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个组氨酸密码子在编码互补性决定区3(CDR3)的核苷酸序列中。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述至少一个组氨酸密码子是一个、两个、三个或四个CDR3密码子的取代。12.根据权利要求1-11任意一项所述的方法，其中所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区来源于人源Vκ1-39或Vκ3-20基因区段。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区来源于重排的Vκ1-39/Jκ5或Vκ3-20/Jκ1基因序列。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区来源于重排的Vκ1-39/Jκ5基因序列，并且其中所述Vκ1-39/Jκ5基因序列包含设计为至少一个非...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·麦克沃克，L·麦克唐纳，A·J·莫菲，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US