本发明专利技术公开了一种用于生产琥珀酸的重组质粒和一种在高产琥珀酸同时又能大大降低生产成本的基因工程菌DYCMG111。本申请还公开了上述重组质粒和基因工程菌的制备方法。本申请同时公开了上述重组质粒以及基因工程菌在制备用于基因工程发酵生产琥珀酸的生物产品中的用途。使用本发明专利技术的重组质粒构建出来的基因工程菌DYCMG111的稳定性高，相比原始菌DC1515，生长速率提高，在加入不同浓度的IPTG诱导剂时，在双阶段发酵时琥珀酸产量都有很大的提高。
【技术实现步骤摘要】
生产丁二酸的重组质粒、基因工程菌的构建及用途
本专利技术属于生物工程领域，涉及一种用于生产丁二酸的重组质粒和一种高产丁二酸的基因工程菌。本申请还涉及上述重组质粒以及基因工程菌的构建方法。本申请同时涉及上述重组质粒以及基因工程菌在制备发酵生物质生产丁二酸的生物产品中的用途。
技术介绍
能源和环保是当今世界面临的重要问题。丁二酸作为一种生物基化学品，是最好的石油替代品之一。丁二酸(IUPACsuccinicacid，中文又名琥珀酸)是一种四碳二羧酸，化学式为HOOC-CH2-CH2-COOH。主要作为有机合成的原料，生产如丁二酸酐、丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯等化工产品；随着催化工艺的发展，丁二酸还可转化为醇酸树脂、油漆、食品调味剂等精细化工产品和医药产品如磺胺药、维生素A、维生素B、抗痉挛剂等。目前全世界市场需求超过2.76×105t/a，且以每年6％-10％的速度增长。目前，大部分工业用丁二酸是以石油为原料通过化学方法来合成，如丁烯二酸催化加氢、氯乙酸甲酯的氰化水解以及石蜡氧化法等，c成本高，且造成环境污染。随着人们可持续发展意识和环保意识的提高，发酵法生产丁二酸进入了人们的视线，引起了研究热潮。一旦实现了丁二酸发酵大规模生产，便可以减少石油资源的使用和石化法带来的严重污染。丁二酸发酵消耗1mol葡萄糖的同时固定1molCO2，消耗了温室效应气体，因此，发酵法生产的丁二酸是一种与乳酸、乙醇等有机物的发酵研究相比，丁二酸发酵研究起步较晚，文献报道也相对较少。综合已有文献来看，菌种研究方面，比较有应用前景的菌种包括产丁二酸厌氧螺菌、产丁二酸放线杆菌和经基因改造的大肠杆菌。这三种菌都是通过混合酸发酵产能，发酵产物为乙酸、乳酸、丁二酸等。但是，丁二酸厌氧螺菌要求绝对厌氧环境，培养条件苛刻。并且，在低二氧化碳水平下，产丁二酸厌氧螺菌发酵葡萄糖以产乳酸为主要产物，而产丁二酸放线杆菌则发酵葡萄糖以产乙醇为主要产物；只有在高CO2浓度的条件下进行发酵才以丁二酸为主要产物，这就需要额外的供气设备，增加产品成本。相比而言，大肠杆菌培养条件简单，菌株本身有多条产丁二酸途径，具有代谢灵活，易于改造的特性。对大肠杆菌丁二酸代谢的研究表明，在以葡萄糖为底物的混合酸发酵中，丁二酸生成是通过三羧酸循环的还原臂生成的，由该途径产生1mol的丁二酸伴随着1molCO2的固定。该途径的关键反应是将三碳中间物：磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)转化为四碳化合物草酰乙酸。草酰乙酸随后被苹果酸脱氢酶转化为苹果酸(malate)，由富马酸合成酶生成富马酸，最后由富马酸裂解酶生成丁二酸。在大肠杆菌发酵葡糖的过程中，有机酸逐渐积累，导致环境的pH值逐渐降低。为了控制细菌生长环境的pH值，需要在发酵液中添加大量的碱中和剂，目前研究的大肠杆菌工程菌发酵葡萄糖产丁二酸的过程中，用到的碱性中和剂有NaOH，Na2CO3，NaHCO3，Mg(OH)2，MgCO3。经过研究，我们发现不同的碱性中和剂对细胞的生长和丁二酸产量有显著影响，见表1。碱中和剂细胞干重葡萄糖利用率(％)丁二酸产量(％)NaOH3.62g/L66.653.5Na2CO34.05g/L89.649.8NaHCO33.87g/L98.259.7Mg(OH)24.18g/L98.553.3MgCO35.36g/L99.471.2表1不同碱中和剂对大肠杆菌生长代谢以及产丁二酸的影响由表中数据可以得到，以MgCO3作为碱中和剂得到的细胞干重，葡萄糖利用率和丁二酸产量均为最高。分析原因有二，第一，以上碱中和剂中，金属阳离子有两个，Na+和Mg2+。在对大肠杆菌代谢的研究中发现，Mg2+离子可以作为磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)代谢生成草酰乙酸过程中的PEP羧化酶的辅因子，而这一步代谢是大肠杆菌生成丁二酸的关键步骤。在大肠杆菌的代谢过程中，Na+对跨膜pH梯度，细胞渗透压有重要影响，且掌管着细胞内的pH值。高的Na+离子浓度会导致细胞渗透过高而影响大肠杆菌的生长和代谢，所以在作为碱性中和剂时，Mg(OH)2比NaOH的效果好，MgCO3比Na2CO3的效果好。第二，以上碱中和剂中，阴离子有CO32-，OH-，HCO3-，在相同浓度下，OH-的pH更大，也就是说在相同阳离子作为碱性中和剂的时候，RCO3比R(OH)2为细菌生长环境提供更多的R2+，因此MgCO3比Mg(OH)2提供更多的Mg2+，而Mg2+是对大肠杆菌生长代谢和产丁二酸都有好处的，因此MgCO3比Mg(OH)2作为碱性中和剂的效果好。MgtA基因是大肠杆菌基因组中的一个基因，可表达镁离子转运蛋白，其作用是运输细胞外Mg2+离子到细胞内。但是MgtA基因的表达受体外Mg2+浓度影响，在Mg2+浓度很低时，MgtA基因几乎不表达。即使体外培养液中Mg2+浓度较高，Mg2+转运效率也受到细胞自身MgtA基因的严紧调控，镁离子转运蛋白表达有限。在高效丁二酸生产菌株中，细胞丁二酸代谢途径关键酶均需要高浓度的Mg2+，这就造成了由于转运蛋白不足造成的体内Mg2+浓度不足，细胞关键酶酶活提高受限，丁二酸生产能力受到严重影响。这也正是MgCO3比Mg(OH)2作为碱性中和剂可达到高产丁二酸的根本原因。说明在改造大肠杆菌生产丁二酸时MgtA基因的高表达可能发挥更好的功效。经过市场调查发现，作为碱性中和剂的MgCO3是4200元到5000元每吨，而Mg(OH)2的价格是3900元每吨，NaOH的价格是2500元每吨。如果MgtA基因能在大肠杆菌内高表达，可以将NaOH和Mg(OH)2的混合物作为碱中和剂来保证丁二酸的高效生产。在确保pH值达到作为碱中和剂的要求的同时，Na+离子的含量不至于达到造成大肠杆菌细胞渗透压过高而影响大肠杆菌生长代谢产丁二酸，而Mg2+离子浓度虽然减少，但MgtA基因的高表达弥补了运输到细胞内的Mg2+离子的减少。这就大大减少了大肠杆菌工程菌产丁二酸的成本，并且提高了大肠杆菌工程菌产丁二酸的产量。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于生产丁二酸，并降低生产成本的重组质粒和一种高产丁二酸的基因工程菌。本专利技术的目的还在于提供一种重组质粒以及基因工程菌的构建方法。本专利技术的目的还在于提供一种重组质粒以及基因工程菌在发酵生产丁二酸的生物产品中的用途。为了充分利用大肠杆菌本身具有的多条丁二酸代谢途径的优势，同时发挥目的基因MgtA提高Mg2+利用率从而提高大肠杆菌代谢流更多流向丁二酸的优势，本专利技术旨在提高本实验室保存的大肠杆菌DC1515的丁二酸产量。DC1515是将野生型大肠杆菌乳酸脱氢酶，丙酮酸甲酸裂解酶，葡萄糖转运蛋白敲除的菌株，可发酵1mol葡萄糖产0.96mol丁二酸。本专利技术提供的重组大肠杆菌DYCMG111，是含有一定拷贝数的携带完整的MgtA基因重组质粒的基因工程菌株DC1515。综上，本专利技术的基本技术构思是：将MgtA基因克隆到质粒载体pTrchisA上，再将重组后的质粒转入工程菌DC1515中，通过MgtA基因的过量表达提高大肠杆菌DC1515吸收Mg+离子的能力来达到提高丁二酸产量的目的。针对本专利技术的专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：一方面，本专利技术提供了一种重组质粒，该重组质粒是携带有MgtA基因的pMD19-T载体(pMD-m本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组质粒，其特征在于，该重组质粒携带完整的MgtA基因及其上下游68个碱基在内的片段；优选地，该重组质粒是携带有序列表中SEQ ID NO：1所示的DNA片段的pMD19‑T载体。
【技术特征摘要】
1.一种重组质粒，其特征在于，该重组质粒携带完整的大肠杆菌MgtA基因的片段，即该重组质粒是携带有序列表中SEQIDNO：2所示的DNA片段的pTrchisA载体。2.一种琥珀酸高产、低成本基因工程菌DYCMG111，其特征在于：所述工程菌是通过将权利要求1所述的重组质粒转入起始菌DC1515中而得到的。3.权利要求1的重组质粒的构建方法，其特征在于，(1)首先设计引物：mgtAup：-5’GGAGGGACTCCTTATGTTTAA3’-，mgtAdown：-5’GCTATCGTGCCCAGTTTAT3’-；以大肠杆菌的总DNA为模板，进行PCR扩增，得到一个长度为2820bp的片段，经测序证实其为序列表中SEQIDNO：1的DNA片段；纯化PCR产物，连接到pMD19-T载体，得到质粒pMD-mgtA1；(2)利用设计的引物pTrchisA-mgtAup：-5’CGATTCGGATCCCTCCTT3’-，划线处为BamHI酶切位点；pTrchisA-mgtAdown：-5’CGTACCCGGAAGCTTTCTAGAGA3’-，划...
【专利技术属性】
技术研发人员：王丹，王競，王洪辉，汪楠，周小华，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：重庆;85
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