铜绿假单胞菌的一种特异性检测方法技术

本发明专利技术描述了一种利用聚合酶链式反应（PCR)技术检测铜绿假单胞菌的方法，和用于PCR的新的核酸引物。本发明专利技术所述检测方法可以显著缩短铜绿假单胞菌的鉴定时间，而且重复性好、可信度高，对铜绿假单胞菌来源及相关鉴定提供依据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物学检测
，具体涉及。
技术介绍
细菌污染是威胁鸡胚培养病毒生产方式的主要难题之一。由于种蛋从生产、运输到进入孵化间，细菌伴随着种蛋进入到病毒生产的相关环节，这是因为细菌可能附在种蛋表面的粪便上、或与消毒剂接触的时间短或耐药性等等原因，导致细菌不可能在消毒环节中予以全部消灭，同时因为细菌生存条件要求较为宽松，在普通环境都能存活，并且繁殖能力特别强，如果在鸡胚接种、尿囊液收获等等因为其中的接种针和收获头受到细菌污染就会导致细菌在不同鸡胚中传播，容易引起细菌污染生产事故，导致生产失败，造成经济损失。为了更好的预防细菌导致鸡胚生产病毒失败，筛选有效的消毒剂或抗生素成为一种必要的手段，但前提是鉴定污染的细菌是哪种细菌，才可以有针对性进行筛选。因此细菌准确鉴定成为关键的环节。 目前细菌鉴定包括有生化鉴定和PCR鉴定，生化鉴定在实际操作中常因结果不确实而无法准确判断，因此不能成为完全决定细菌种类的手段，而基因扩增鉴定(PCR鉴定)可以有针对性的扩增细菌的基因16SrDNA，再通过测序和序列对比，从而确定细菌的种类，是公认的鉴定一种微生物类别的主要手段。 经过研究和鉴定，对于经常引起生产失败的细菌主要是铜绿假单胞菌，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)又称绿脓杆菌,是一种单生鞭毛,运动活泼,无芽胞,专性需氧的革兰氏阴性杆菌，广泛存在于水、土壤、空气、以及人和动物机体皮肤及肠道中，为饮用水中的主要污染源之一。铜绿假单胞菌可产生多种内外毒素，导致急性肠道疾病和皮肤炎症，此外，因其具有多重耐药能力，在特定条件下，该菌还可引起继发感染或混合感染，弓丨发肺炎、脑膜炎、败血症等，严重时可导致死亡。目前，在铜绿假单胞菌的检测技术方面，国内外标准中仍沿用传统的理化检测方法，包括涂布法、多试管MPN法、滤膜法等，需要纯培养和生化鉴定等多个步骤，整个检测周期3-5天，灵敏度低，且不能满足现场快速检测的需要。 而上述的PCR鉴定需要测序和比对，时间一般要5天左右，而针对这种细菌建立特异性的检测方法，通过特异性引物和扩增片段大小就可以直接判断结果，I天就可以得到结果，这可以为筛选有效的消毒剂或抗生素赢得时间，可以减少或避免细菌污染事故。 因此提供一种及时、快速、重复性好、可信度高的铜绿假单胞菌的特异性检测方法，就成为了急需解决的问题。
技术实现思路
鉴于现有技术的不足，本专利技术的目的是提供，不仅能够快速诊断出铜绿假单胞菌而且重复性好、可信度高。 本专利技术具体技术方案如下:一种铜绿假单胞菌的特异性检测引物，包括上下游引物5’ -GACGGGTGAGTAATGCCTA-3’和 5’-CACTGGTGTTCCTTCCTATA-3’ 。 一种铜绿假单胞菌的检测方法，采用上述检测引物。 所述检测方法所得特异性片段大小为616kb。 所述铜绿假单胞菌的检测方法，包括如下步骤:a.抽提细菌基因组DNA ;b.16SrDNA分子特异性PCR引物扩增；c.鉴定特异性扩增产物。 步骤b所述PCR引物扩增的反应体系由25PL PCR Mixture、2PL上下游引物溶液、2μ? DNA模板、2lPLddH20组成共50μ?反应体系。 步骤b所述PCR引物扩增的反应条件为:94°C预变性5 min ;94°C变性Imin，53 °C退火30s, 72°C延伸1.5min, 30个循环；最后72°C再延伸1min0 步骤c所述鉴定特异性扩增产物的方法为取PCR扩增产物5μ?，于1%琼脂糖凝胶中120V电泳15min，利用凝胶成像系统拍摄。 所述铜绿假单胞菌的检测方法，具体步骤为:(O将没有杂菌的铜绿假单胞菌用营养液培养后抽取部分菌液，抽提细菌基因组DNA用于16S rDNA分子特异性PCR鉴定； (2)由25PL PCR Mixture、2PL 上下游引物溶液、2μ? DNA 模板、2lPLddH20 组成 50μ? 反应体系，反应条件为:94°C预变性5 min ;94°C变性lmin，53°C退火30s，72°C延伸1.5min, 30个循环；最后72°C再延伸1min ；(3)取PCR扩增产物5μ?，于1%琼脂糖凝胶中120V电泳15min，利用凝胶成像系统拍摄。 本专利技术针对铜绿假单胞菌的16S rDNA的保守基因序列设计出了一对特异性上下游引物，分别为 5’ -GACGGGTGAGTAATGCCTA-3’ 和 5’ -CACTGGTGTTCCTTCCTATA-3’，特异性片段大小为616kb。用恶臭假单胞菌、大肠杆菌、柠檬酸杆菌、蜡样芽胞杆菌以及不同来源确定的铜绿假单胞菌作为试验样品，利用上述引物进行扩增检测，只有铜绿假单胞菌可以检出特异性片段，结果见图1。证明了本专利技术所述方法特异性高。 本专利技术所述检测方法可以显著缩短铜绿假单胞菌的鉴定时间，而且重复性好、可信度高，对铜绿假单胞菌来源及相关鉴定提供依据。 【附图说明】 图1为特异性引物扩增结果，其中M:DL2000 Mark er，a:恶臭假单胞；b:大肠杆菌；c:柠檬酸杆菌；d:蜡样芽胞杆菌；S1至S4为不同来源经确诊的铜绿假单胞菌。 【具体实施方式】 以下是进一步描述本专利技术的实施例。这些实施例不应被认为是对本专利技术的限制。本领域技术人员应理解在形式上和详细内容上的各种改变并不违背在所附权利要求中详细标明的本专利技术的实质和范围。实施例1PCR 扩增引物，包括序列 5’-GACGGGTGAGTAATGCCTA-3’ 和5’ -CACTGGTGTTCCTTCCTATA-3’，特异性片段大小为616kb。操作步骤:(O将没有杂菌的铜绿假单胞菌用营养液培养后抽取部分菌液，抽提细菌基因组DNA用于16S rDNA分子特异性PCR鉴定； (2)由25PL PCR Mixture、2PL 上下游引物溶液、2μ? DNA 模板、2lPLddH20 组成 50μ? 反应体系，反应条件为:94°C预变性5 min ;94°C变性lmin，53°C退火30s，72°C延伸1.5min, 30个循环；最后72°C再延伸1min ；(3)取PCR扩增产物5μ?，于1%琼脂糖凝胶中120V电泳15min，利用凝胶成像系统拍摄。 用恶臭假单胞菌、大肠杆菌、柠檬酸杆菌、蜡样芽胞杆菌以及不同来源确定的铜绿假单胞菌作为试验样品，利用上述引物进行扩增。结果见附图1。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种铜绿假单胞菌的特异性检测引物，包括上下游引物5'‑GACGGGTGAGTAATGCCTA‑3'和5'‑CACTGGTGTTCCTTCCTATA‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种铜绿假单胞菌的特异性检测引物，包括上下游引物5’-GACGGGTGAGTAATGCCTA-3’ 和 5’-CACTGGTGTTCCTTCCTATA-3’ 。2.—种铜绿假单胞菌的检测方法，其特征在于，采用权利要求1所述检测引物。3.根据权利要求2所述铜绿假单胞菌的检测方法，其特征在于，所述检测方法所得特异性片段大小为616kb。4.根据权利要求2所述铜绿假单胞菌的检测方法，其特征在于，该方法包括:a.抽提细菌基因组DNA ；b.16S rDNA分子特异性PCR引物扩增；c.鉴定特异性扩增产物。5.根据权利要求4所述铜绿假单胞菌的检测方法，其特征在于，步骤b所述PCR引物扩增的反应体系由25PL PCR Mixture、2PL上下游引物溶液、2PL DNA模板、2lPLddH20组成共50μ?反应体系。6.根据权利要求4所述铜绿假单胞菌的检测方法，其特征在于，步骤b所述PCR引物扩增的反应条件为:94°C预变性5 min ;9...

【专利技术属性】
技术研发人员：张文炎，刘锦容，詹烜子，梁雄权，
申请(专利权)人：肇庆大华农生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44