本发明专利技术公开了一种茶藨子木层孔菌多糖及其制备方法和应用，属于多糖领域。本发明专利技术制备的茶藨子木层孔菌多糖，结构新颖，是首次分离得到；其结构含有可重复的单元结构，该可重复单元结构由3个(1→3)-β-D-葡萄糖构成主链，在主链的其中一个(1→3)-β-D-葡萄糖的C6位有一个分枝，分枝由3个(1→6)-β-D-葡萄糖串联而成。本发明专利技术还公开了一种茶藨子木层孔菌多糖的制备方法，该方法简单、适用，提取的多糖纯度高达93%以上，制备的多糖可用于制备治疗阿尔茨海默病等神经退行性疾病的药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及多糖领域，具体涉及一种茶藨子木层孔菌多糖及其制备方法和应用。
技术介绍
阿尔茨海默病，是一种在老年期发生的以进行性痴呆为主要特征的神经元退行性疾病。随着世界人口日趋老龄化，阿尔茨海默病发病率越来越高，已成为继心血管疾病、癌症和中风之后的第四大杀手，严重危害着老年人的身体健康和生活质量。目前用于治疗阿尔茨海默病的药物大概有10余种，主要是拟胆碱药物和改善脑代谢的益智药，其中乙酰胆碱酶抑制剂（拟胆碱药）是目前治疗阿尔茨海默病的一线药物，如他克林（Tacrine）、多奈派齐（Donepezil）、利斯的明（Rivastigmine）、加兰他敏（Galanthamine）和石杉碱甲等。临床上应用的这些药物只能缓解早期病人的认知障碍，提供适度的症状改善作用，无法阻止病情的进展。到目前为止，仍缺乏对因治疗和控制疾病进程的有效药物。神经生长因子(nerve growth factor, NGF), 作为神经营养因子家族中最重要的成员，对退化的多巴胺能神经元细胞及促进纹状体多巴胺系统神经元细胞的再生有潜在的保护作用，有望治愈阿尔茨海默病。然而，NGF作为蛋白类物质，存在化学性质不稳定、体内半衰期短、药代动力学特性欠佳等缺点，且不易通过血脑屏障，并且价格昂贵，限制了其临床的应用。因此，积极寻找具有神经营养的“NGF”样的其他化合物用于阿尔茨海默病的治疗具有重要的意义。茶藨子木层孔菌多糖是从药用真菌茶藨子木层孔菌(Phellinus ribis)中分离获得的具有神经营养活性的均一多糖组分，研究表明其在10 μg/ml-150μg/ml范围内能够显著促进NGF介导的PC12神经突的生长，可望开发成阿尔茨海默病等神经退行性疾病治疗的候选药物。关于茶藨子木层孔菌多糖神经营养作用的研究在本专利技术完成之前没有相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有药用价值的茶藨子木层孔菌多糖及其制备方法和应用。本专利技术的茶藨子木层孔菌多糖，结构新颖，是首次分离得到，命名为PRG；其制备方法简单、适用，提取的多糖纯度高达93%以上。该产品可用于制备治疗阿尔茨海默病等神经退行性疾病的药物。本专利技术采用以下技术方案：一种茶藨子木层孔菌多糖，其特征在于，其单糖组成为β-D-葡萄糖，其结构中有可重复单元结构；所述可重复单元结构由3个(1→3)-β-D-葡萄糖构成主链，在主链的其中一个(1→3)-β-D-葡萄糖的C6位有一个分枝，分枝由3个(1→6)-β-D-葡萄糖串联而成，其重复单元结构式如下： 。所述的茶藨子木层孔菌多糖中末端葡萄糖、(1→3)-β-D-葡萄糖、(1→6)-β-D-葡萄糖和(1→3，6)-β-D-葡萄糖的组分摩尔比约为1:2:2:1；所述的茶藨子木层孔菌多糖，重均分子量为5.16×103Da，比旋光度+32.1° (c 0.1, H2O)。一种茶藨子木层孔菌多糖的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：（1）水提：取茶藨子木层孔菌子实体粗粉，加20倍-40倍重量的蒸馏水，90℃-100℃提取4次，每次4h-6h，滤过，合并滤液，浓缩，加乙醇至含醇量80%，静置24h，离心，得茶藨子木层孔菌总多糖粗品；（2）去蛋白：将步骤（1）所得的总多糖粗品溶于蒸馏水中，用蛋白酶酶解，灭活并离心除去变性蛋白酶，离心所得上清液加入有机溶剂，振荡，离心，除去下层有机相和中间蛋白层，重复有机溶剂处理的步骤直至无白色沉淀产生，得到去蛋白后的多糖水提液；（3）分级醇沉：将步骤（2）中的水提液浓缩，加乙醇至含醇量50%，离心，弃去沉淀物，上清液继续加乙醇至含醇量80%，静置，离心，沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，真空干燥，得茶藨子木层孔菌分级多糖粗品；（4）柱层析：将步骤（3）得到的茶藨子木层孔菌分级多糖粗品溶解后经DEAE-纤维素柱层析，苯酚-硫酸法检测多糖，收集第二洗脱峰的洗脱液后将其再经凝胶柱层析，苯酚-硫酸法检测多糖，收集主峰的洗脱液，洗脱液经浓缩、透析和冻干后得到本专利技术的茶藨子木层孔菌多糖。上述步骤（1）中，所述离心速度为3000rpm-4000rpm，时间为15min-30min；上述步骤（1）中，加入茶藨子木层孔菌30倍重量的蒸馏水，提取温度为95℃，提取时间为每次6h，离心速度为3000rpm，离心时间为20min。上述步骤（2）中，所述蛋白酶为胰蛋白酶；所述有机溶剂为氯仿和正丁醇，所述氯仿和正丁醇的体积比为5：1。上述步骤（3）中，所述乙醇为无水乙醇；离心速度为3000rpm，离心时间为20min。上述步骤（4）中，所述DEAE-纤维素柱层析的条件为：分步洗脱，洗脱液依次为蒸馏水、0.05mol/L NaCl溶液、0.1mol/L NaCl溶液和0.2mol/L NaCl溶液，流速为2ml/min。上述步骤（4）中，所述的凝胶为Superdex 30，凝胶过滤层析条件为：洗脱液为0.05mol/L NaCl溶液，流速为0.5ml/min。所述的茶藨子木层孔菌多糖可以应用于治疗神经退行性疾病的药物中。本专利技术具有如下优点：本专利技术茶藨子木层孔菌多糖（PRG），是首次从茶藨子木层孔菌中分离获得，为一新的结构新颖的葡聚糖。PRG由末端葡萄糖、1→3连接的葡萄糖、1→6连接的葡萄糖和1→3，6连接的葡萄糖组成，组分摩尔比为1:2:2:1。IR证明PRG是糖类，为β-构型。该多糖重均分子量5.16×103Da，比旋光度+32.1° (c 0.1, H2O)。 PRG能够促进NGF介导的PC12神经突的生长，具有较强的神经营养活性，为首次研究发现，可用于制备神经退行性疾病治疗的药物。此活性多糖在本专利技术之前未见报道。附图说明图1为PRG的HPSEC-MALLS色谱图。图2为PRG在200nm-400nm紫外扫描图谱。图3为标准单糖糖腈乙酸酯衍生后后的气相色谱图。图4为PRG水解产物糖腈乙酸酯衍生后的气相色谱图。图5为PRG的红外光谱。图6为PRG的核磁共振谱图 (a) 1H NMR, (b) 1C NMR, (c) DEPT。图7为PC12细胞形态学观察。图8为PRG促进PC12细胞神经突生长的定量分析。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述。实施例1茶藨子木层孔菌多糖的制备，它包括以下步骤：（1）水提取：将茶藨子木层孔菌子实体粉碎成粗粉，加入30倍量蒸馏水（g/ml），混合均匀后于恒温水浴锅中95℃提取4次，每次6h，纱布滤过，合并水提液，浓缩，加入4倍水提液体积的无水乙醇，静置24h，3000rpm离心20min，得茶藨子木层孔菌总多糖粗品。（2）去蛋白：将步骤（1）所得的茶藨子木层孔菌总多糖粗品溶于蒸馏水中，得到茶藨子木层孔菌粗多糖水溶液， 加入粗多糖重量1%的蛋白酶，4本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种茶藨子木层孔菌多糖，其特征在于，其单糖组成为β‑D‑葡萄糖，其结构中有可重复单元结构；所述可重复单元结构由3个(1→3)‑β‑D‑葡萄糖构成主链，在主链的其中一个(1→3)‑β‑D‑葡萄糖的C6位有一个分枝，分枝由3个(1→6)‑β‑D‑葡萄糖串联而成，其重复单元结构式如下：。
【技术特征摘要】
1.一种茶藨子木层孔菌多糖，其特征在于，其单糖组成为β-D-葡萄糖，其结构中有可重复单元结构；所述可重复单元结构由3个(1→3)-β-D-葡萄糖构成主链，在主链的其中一个(1→3)-β-D-葡萄糖的C6位有一个分枝，分枝由3个(1→6)-β-D-葡萄糖串联而成，其重复单元结构式如下：
。
2.根据权利要求1所述的茶藨子木层孔菌多糖，其特征在于，所述茶藨子木层孔菌多糖中末端葡萄糖、(1→3)- β-D-葡萄糖、(1→6)- β-D-葡萄糖和(1→3，6)- β-D-葡萄糖的组分摩尔比约为1:2:2:1；所述的茶藨子木层孔菌多糖，重均分子量为5.16×103Da。
3.一种权利要求1所述的茶藨子木层孔菌多糖的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：
（1）水提：取茶藨子木层孔菌子实体粗粉，加20倍-40倍重量的蒸馏水，90℃-100℃提取4次，每次4h-6h，滤过，合并滤液，浓缩，加乙醇至含醇量80%，静置24h，离心，得茶藨子木层孔菌总多糖粗品；
（2）去蛋白：将步骤（1）所得的总多糖粗品溶于蒸馏水中，用蛋白酶酶解，灭活并离心除去变性蛋白酶，离心所得上清液加入有机溶剂，振荡，离心，除去下层有机相和中间蛋白层，重复有机溶剂处理的步骤直至无白色沉淀产生，得到去蛋白后的多糖水提液；
（3）分级醇沉：将步骤（2）中的水提液浓缩，加乙醇至含醇量50%，离心，弃去沉淀物，上清液继续加乙醇至含醇量80%，静置，离心，沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，真空干燥，得茶藨子木层孔菌分级多糖粗品；
（4）柱层析：将步骤（3）得到的茶藨子木层孔菌分级多糖粗品溶解后经DEAE-纤维素柱层析，苯酚-硫酸法检测多糖...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘玉红，周洪雷，蒋海强，徐凌川，
申请(专利权)人：山东中医药大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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