本发明专利技术属于生物技术领域，提供了一种调控杜泊羊骨骼肌生长的MYL4基因cDNA序列的克隆方法，该基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。应用该基因可以通过对其表达调控进行操作，为实现培育生长速度快的绵羊品种奠定基础，具有重要的现实意义。
【技术实现步骤摘要】
-种调控杜泊羊骨骼肌生长的MYL4基因及其应用
本专利技术属于分子生物学领域，具体地说，本专利技术涉及一种可以调控杜泊羊骨骼肌 生长的MYL4基因及其在绵羊育种中的应用。
技术介绍
肌球蛋白轻链4 (MYL4)为肌球蛋白轻链家族中的一员，是一种基本性轻链。研究 发现该基因在猪和小鼠骨骼肌发育中差异表达，并且在具有不同生长速度的品种猪的骨骼 肌间的表达也差异显著，因而认为该基因具有调控骨骼肌生长和发育的功能。目前，绵羊基 因组中公布了 MYL4基因的预测序列，还未见到该基因的确切序列报道，并且关于该基因对 肌肉生长和发育的调控机制还不十分清楚。
技术实现思路
基于上述的原因，本专利技术提供了一种可以调控杜泊羊骨骼肌生长的MYL4基因，其 cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示，除poly (A)外长为869bp ;该序列中的开放读码框编码193 个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。该基因具有调控骨骼肌生长的功能，应用该基 因可以通过对该基因的表达调控进行操作，为实现培育生长速度快的绵羊品种奠定基础， 具有重要的现实意义。 本专利技术所提供的调控小尾寒羊骨骼肌生长的MYL4基因，其CDNA序列如SEQ ID NO. 1所示，除poly(A)外长为869bp ;该序列中的开放读码框编码193个氨基酸，氨基酸序 列如SEQ ID NO. 2所示。 上述的MYL4基因是通过如下方法获得的： (1)杜泊羊肌肉总RNA的提取和反转录： 采用TRIzol法提取杜泊羊肌肉组织总RNA，提取的RNA以Agilent 2100 Bioanalyzer进行检测，要求总RNA含量在10 μ g以上且RIN(RNA完整性指标）彡7. 5,并 根据现有技术经Roche公司的cDNA反转录试剂盒反转录合成cDNA第一链； (2)MYL4基因 cDNA序列保守区的扩增： 比对已有物种MYL4基因的cDNA序列，根据保守区设计上下游引物，以步骤⑴中 的cDNA第一链为模板进行PCR扩增克隆测序得到保守区序列； ⑶应用3'降落巢式PCR法对MYL4基因 cDNA序列的3'端进行扩增： 根据所得保守区序列设计MYL4基因的3'特异内侧和外侧引物； 以3'特异外侧引物和3'通用外侧引物采用退火温度逐渐降落法对上述cDNA第 一链进行第一轮PCR扩增； 然后以3'特异内侧引物和3'通用内侧引物采用同样的退火温度逐渐降落法对 第一轮PCR扩增产物进行第二轮PCR扩增； 对第二轮PCR产物经克隆测序得到MYL4基因 cDNA序列的：V端序列； (4)应用Y RACE法对MYL4基因 cDNA序列的5'端进行扩增： 对杜泊羊肌肉组织经TRIzol法所提总RNA依次进行常规的去磷酸化处理、去帽 子反应、与接头序列连接并以TaKaRa公司的Y -Full RACE Kit With TAP试剂盒反转 录合成cDNA的第一链； 根据所得保守区序列设计MYL4基因的5'特异外侧和特异内侧引物； 以5'特异外侧和5'通用外侧引物进行第一轮PCR扩增； 以Y特异内侧和Y通用内侧引物进行第二轮PCR扩增； 内侧PCR产物经克隆测序得到MYL4基因 cDNA序列的Y端序列； (5)全长序列拼接及克隆测序验证： 根据重叠区域对上述步骤获得的cDNA的保守区、5'和3'所得序列进行拼接，获 得MYL4基因的全长cDNA序列；设计两端序列为上下游引物，PCR扩增并克隆测序得到MYL4 基因的全长cDNA序列，具有如SEQ ID NO. 1的核苷酸序列。 对该cDNA序列进行生物信息学分析，得到该基因编码产生含有193个氨基酸的蛋 白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。 之后专利技术人利用qRT-PCR法测定MYL4基因在生长速度不同的杜泊羊和小尾寒羊 的心、肝、肌肉等组织中的表达量，发现该基因在杜泊羊背最长肌中表达但在小尾寒羊背最 长肌中不表达，表明该基因具有调控骨骼肌生长的功能。 综上所述，本专利技术提供了一种可以调控绵羊骨骼肌生长的MYL4基因，应用该基因 可以通过对该基因的表达调控进行操作，为实现培育生长速度快的绵羊品种奠定基础，具 有重要的现实意义。 【附图说明】 图1为本专利技术中杜泊羊MYL4基因 cDNA保守区扩增图， 图中M为DL2000分子量标准；另一条为MYL4基因 cDNA保守区序列； 图2为本专利技术中杜泊羊MYL4基因3'端扩增图， 图中M为DL2000分子量标准；另一条为MYL4基因 cDNA的3'端序列； 图3为本专利技术中杜泊羊MYL4基因 Y RACE扩增图， 图中M为DL2000分子量标准；另一条为MYL4基因 cDNA的5'端序列； 图4为本专利技术中杜泊羊MYL4基因 cDNA全长序列扩增图， 图中M为DL2000分子量标准；另一条为MYL4的全长cDNA序列； 图5为本专利技术中MYL4在小尾寒羊和杜泊羊不同组织中的表达水平柱状图， 图中A、B、C、D表示杜泊羊各组织间的差异显著性，a、b表示小尾寒羊各组织间的 差异显著性（P〈〇. 05) ;MYL4在杜泊羊的背最长肌中表达而在小尾寒羊背最长肌中不表达。 【具体实施方式】 以下结合附图对本专利技术的上述
技术实现思路
作进一步的详细描述。应理解，这些实施 例仅为了说明本专利技术而不是为了限制本专利技术的保护范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照制造厂商所建议的实验条 件或常规方法，如Sambrook等编著的分子克隆实验手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件。 实施例I :杜泊羊背最长肌组织总RNA的提取及反转录 取杜泊羊背最长肌约20g，使用康为世纪公司的总RNA提取试剂盒（No. CW0580)提取肌肉组织的总RNA ;将提取的RNA采用Roche公司的cDNA反转录试剂盒 (No. 05081955001)反转录合成cDNA第一链，-20°C保存备用。 实施例2 :cDNA保守区序列的克隆与测序 (1)引物的设计：从NCBI上下载人、猪、牛、鼠等各物种MYL4基因的cDNA序列， 以DNAMN 6. 0软件进行比对获得保守区序列，设计该基因 cDNA的保守区引物为：Fl : GATAGACTTCACTGCTGACCAG，如 SEQ ID NO. 3 所示，和 F2 :CCCAGACATGATGTGCTTG，如 SEQ ID NO. 4所示； (2) PCR扩增：以实施例1获得的cDNA第一链为模板，采用TIANGEN的PCR MasterMix试剂盒（KT201)进行PCR扩增；50μ 1扩增体系中包含：PCR MasterMix 25μ 1 ; Fl(10X)2y I ;F2(10X)2y I ;cDNA 第一链 2μ 1。扩增条件为：94°C，5min ;(94°C 30s， 58°C 30s，72°C lmin)35cycles ;72°C，10min。扩增结果见附图 I ; (3)扩增条本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种调控杜泊羊骨骼肌生长的MYL4基因，其特征在于：具有如SEQ ID NO.1所示的cDNA序列，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1. 一种调控杜泊羊骨骼肌生长的MYL4基因，其特征在于：具有如SEQ ID NO. 1所示的 cDNA序列，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所不。2. 根据权利要求1所述的MYL4基因，其特征在于：...
【专利技术属性】
技术研发人员：王建民，张春兰，刘冠卿，刘昭华，纪志宾，秦孜娟，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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