一种免疫复合物吸附细胞的制作方法技术

本发明专利技术公开了一种免疫复合物吸附细胞的制作方法，步骤包括载体构建、病毒包装制作、永生化B淋巴细胞制作和基因转染，本发明专利技术制作出了一套分别携带有特定基因的永生化的细胞，具有永生化(无限增殖分裂能力)和表达某一种免疫复合物受体于细胞表面的能力，通过扩增培养的细胞，建立免疫复合物分析组合，一次可以对血液或者身体组织的各种免疫复合物进行识别、分类、定量。还具有低成本无限增殖、检测速度快，操作简单等特点。本发明专利技术的目的是为了得到永生化的B淋巴细胞，该B淋巴细胞是能稳定表达一种免疫复合物受体基因，并且该受体能在细胞膜上存在，并能结合细胞外的对应的一种免疫复合物，并不局限于永生化B细胞。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种细胞制作的方法，具体是。
技术介绍
免疫复合物：抗体与抗原结合所得到的一种复合物称为免疫复合物，是由各种免 疫细胞吞噬细菌，病毒，致敏物质共同死亡后结合而形成的，所以又称抗原一抗体复合物。 它在正常情况下，小分子可溶性免疫复合物被肾小球滤过排出，大分子不溶免疫复合物被 巨噬细胞吞噬消灭，这是机体防御机制的一部分。但在某些情况下，抗原与抗体在体内形成 的免疫复合物，沉积于血管壁基底部，从而激活补体，被激活的补体，发挥溶解细菌、病毒、 肿瘤细胞等作用。 永生化细胞：一种细胞生物学术语。指动物细胞脱分化失败，受到病毒感染，外源 恶意代码转染，辐射或药剂作用后，细胞分裂次数限制机制和DNA检查-自毁机制失灵，导 致具有无限分裂生长的能力的过程。细胞永生化是癌变的必经途径。 抗原和相应抗体结合形成的物质称为免疫复合物。由于免疫复合物能在循环血液 中检测到，故亦称之为循环免疫复合物。它和补体、其他免疫活性物质结合，沉积在血管壁， 可导致组织损伤及血管炎，引起一系列的疾病，如红斑狼疮。免疫复合物在体内存在有两种 方式，一是存在于血液中的循环免疫复合物（CIC)，一是组织中固定的免疫复合物。免疫复 合物的检测技术可分为抗原特异性方法和非抗原特异性方法。在大多数情况下，免疫复合 物中的抗原性质不太清楚或非常复杂，所以抗原特异性方法并不常用。 根据形成免疫复合物的抗原-抗体的已知或未知的将CIC分为两大类，前者为特 异性免疫复合物（如乙型肝炎的HBsAg-抗-HBs，甲状腺蛋白抗原-甲状腺球蛋白抗体形成 的免疫复合物）；后者为非特异性免疫复合物（如肾小球肾炎、系统性红斑狼疮等）。 抗原与抗体在体内形成的免疫复合物，沉积于血管壁基底部，从而激活补体，被激 活的补体，发挥溶解细菌、病毒、肿瘤细胞等作用。 免疫复合物的疾病有： 1)血清病：是由大小免疫复合物沉积在毛细血管壁，补体、吞噬细胞参与反应所 致。 2)免疫复合物型肾小球炎：是由链球菌可溶性抗原与抗体结合，沉积于肾小球基 底膜，激活补体，吸引中性粒细胞，释放各种酶类损伤肾小球所致。 3)类风湿性关节炎：是由类风湿因子与免疫球蛋白IgG结合形成的免疫复合物， 沉积于关节骨膜、皮下组织等处引起类风湿关节炎等。 4)系统性红斑狼疮（SLE):是自身免疫疾病的一种，其病理机制还未明确，但 患者血清中常含有多种自身抗体和大量致病性循环免疫复合物（circ μ Lating immune complexes，CIC)，CIC的出现会激活补体，并沉积于毛细血管壁、肾小球基底膜以及其他血 管外组织中，造成炎症反应和免疫病理损伤。 免疫复合物的检测技术可分为抗原特异性方法和非抗原特异性方法。在大多数情 况下，免疫复合物中的抗原性质不太清楚或非常复杂，所以抗原特异性方法并不常用。根据 免疫复合物的物理学、免疫学和生物学特性，已经设计出很多检测CIC的方法。 (一）物理测定法 L聚乙二醇法 聚乙二醇（PEG)是乙二醇聚合而成的无电荷形多糖分子，分子量变化范围较大， 常用的分子量是6000。用3%?4%浓度的PEG可以选择性地将大分子免疫复合物沉淀下 来，其作用机制尚不甚清楚。将PEG溶液与待检血清混合，置4°C冰箱过夜后离心，将沉淀物 用PEG溶液充分洗涤，重新溶解于0. Olmol/L的NaOH中，在波长280nm下测量溶液的吸光 度；也可利用散射比浊法直接测定PEG沉淀的免疫复合物；以不同浓度的热聚合IgG作为 参考标准来计算CIC的含量。 聚乙二醇法简单易行，可在临床工作中推广。但此法易受多种大分子蛋白和温度 的干扰，特异性稍差。PEG法还特别适用于沉淀获得CIC，再进行解离分析其中的抗原与抗 体。 2.冷球蛋白测定在某些病理情况下，血清中的免疫复合物具有可逆性冷沉淀的特 性，于4°C冰箱中放置1?3天可自发地沉淀下来（参见第二十六章）；此种情况多见于冷 球蛋白血症，所涉及的抗原包括自身的IgG、IgM、核苷酸、肿瘤相关抗原、肾小管上皮、甲状 腺球蛋白、红细胞基质等，还有外源性抗原如乙肝病毒、EB病毒、巨细胞病毒、牛白蛋白和马 蛋白等。 (二）补体相关测定法 IgG和IgM类抗体与抗原结合后，重链CH2区的补体结合点暴露，可以固定Clq并 激活补体的系列反应，这是利用补体有关技术检测免疫复合物的基础。 I. Clq结合试验将待检血清先行加热56°C 30min，以灭活其中的补体和破坏已与 CIC结合的Clq，空出补体结合点。CIC与Clq的结合可用多种方法进行检测，常用的有以下 3种。 (1)液相法：先将同位素标记的Clq与灭活过的血清标本混合作用，再加入0. 5% (终浓度）的PEG将结合了 Clq的CIC沉淀下来，通过检测沉淀物中的放射活性来计算CIC 的含量。 (2)固相法：先将Clq吸附于固相载体表面，加入待检血清使CIC与Clq结合，再 加入同位标记的或酶标记的抗人IgG或SPA，最后检测其放射活性或酶活性。 (3) Clq偏离试验：先将同位素标记的Clq与灭活的血清标本混合，再加抗体致敏 的绵羊红细胞，温育后离心，检测红细胞上的放射活性。红细胞的放射活性与免疫复合物的 量呈负相关。 2.补体试验本法的原理类似补体结合试验。将一定量的补体（多为混合豚鼠血 清）与灭活的待检血清混合温育，反应后加入致敏绵羊红细胞。如出现溶血表示血清中没 有CIC存在；不溶血说明标本中有CIC存在。将血清标本做不同稀释，并与已知的热聚合 IgG作对照，可以计算出CIC的含量。本方法的灵敏度较高，且易于在一般实验室开展，不足 之处是特异性较差。 3.胶固素结合试验胶固素（conglutinin)是牛血清中的一种正常蛋白，能与C3d 特异性结合；体内与补体结合的CIC都带有C3d，因此胶固素可与CIC结合。用一定量的胶 固素包被塑料管，往管中加入稀释的血清标本，温育后再加入同位素标记或酶标记的抗人 IgG抗体，最后检测各管的放射活性或酶活性，计算CIC的含量。 胶固素性质稳定、容易保存、来源方便、价格便宜，检测方法也不复杂，便于推广。 本法的不足是只能检出已结合补体的CIC，但不论何种激活途径都一样检出，并可用作CIC 分离。 (三）抗球蛋白测定法 类风湿因子（RF)为抗IgG的自身抗体，与变性IgG、热聚合IgG和IC都有较强的 亲和力。单克隆RF(mRF)可从待发性冷球蛋白血症的血清中提取，多克隆RF(pRF)可从类 风湿性关节炎的血清中提取。用mRF比pRF的敏感性更高一些。 I. mRF固相抑制试验将mRF吸附于固相载体上，随后加入血清标本，再加入同位素 标记的可溶性热聚合IgG。如果标本中含有1C，固相mRF已与IC结合，热聚合IgG与mRF 的结合使被抑制，所以固相中的放射活性与CIC的含量呈负相关。 也可用同位素标记的mRF先与血清标本反应，再加入热聚合IgG附着的琼脂糖珠， 温育并离心洗涤后测量沉淀物的放射强度，测定值与CIC的含量呈负相关。此法的敏感性 比前法更高一些。 2. pRF胶乳凝集抑制试验将pRF与血本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种免疫复合物吸附细胞的制作方法，其特征在于，步骤包括载体构建、病毒包装制作、永生化B淋巴细胞制作和基因转染，所述载体构建的步骤为：(1.1)设计三个基因，分别是CR1、CR2和CD93；这三个基因是补体系统的膜上信号蛋白受体，且分别结合血液中的C3b、C3d和C1q补体蛋白，起到捕获作用；设计引物为：CR1上游引物序列：5’‑CTCGAGCGGAGCACAATGATTGGTCA‑3’CR1下游引物序列：5’‑CCTAGG TGGCTCCTTTCCCACCAAAA‑3’CR2上游引物序列：5’‑CTCGAGGGGTCTCGGAACGCATCC‑3’CR2下游引物序列：5’‑CCTAGGTCCAAGCAATGAGGCACACA‑3’CD93上游引物序列：5’‑CTCGAGGCCACACAGAGACCGGG‑3’CD93下游引物序列：5’‑CCTAGGTGTCTCTAGGGCCACCTCAC‑3’。(1.2)DNA提取为了克隆出全长的CR1、CR2和CD93序列，使用DNA抽屉试剂盒从海拉细胞中抽提出DNA，再以上述引物为模板，通过PCR反应分别克隆出三个基因的基因片段；(1.3)质粒构建和扩增、获取根据现代生物分子技术，通过酶切酶连技术，将pLVX‑IRES‑Neo从XhoI和BamHI酶切位点切开，再使用连接酶将之前获得的基因片段连接到pLVX‑IRES‑Neo中；将pLVX‑IRES‑Neo转入感受态菌株中，扩增培养，最后抽提感受态菌株的质粒；所述XhoI酶切位点序列为：CTCGAG；BamHI酶切位点序列为：GGATCC。...

【技术特征摘要】
1. 一种免疫复合物吸附细胞的制作方法，其特征在于，步骤包括载体构建、病毒包装制 作、永生化B淋巴细胞制作和基因转染， 所述载体构建的步骤为： (1. 1)设计三个基因，分别是CR1、CR2和⑶93 ;这三个基因是补体系统的膜上信号蛋白 受体，且分别结合血液中的C3b、C3d和Clq补体蛋白，起到捕获作用； 设计引物为： CR1 上游引物序列：5' -CTCGAGCGGAGCACAATGATTGGTCA-3' CR1 下游引物序列：5' -CCTAGG TGGCTCCTTTCCCACCAAAA-3' CR2 上游引物序列：5' -CTCGAGGGGTCTCGGAACGCATCC-3' CR2 下游引物序列：5' -CCTAGGTCCAAGCAATGAGGCACACA-3' CD93 上游引物序列：5' -CTCGAGGCCACACAGAGACCGGG-3' CD93 下游引物序列：5' -CCTAGGTGTCTCTAGGGCCACCTCAC-3'。 (1. 2)DNA 提取 为了克隆出全长的CR1、CR2和CD93序列，使用DNA抽屉试剂盒从海拉细胞中抽提出 DNA，再以上述引物为模板，通过PCR反应分别克隆出三个基因的基因片段； (1.3)质粒构建和扩增、获取 根据现代生物分子技术，通过酶切酶连技术，将pLVX-IRES-Neo从Xhol和BamHI 酶切位点切开，再使用连接酶将之前获得的基因片段连接到pLVX-IRES-Neo中；将 pLVX-IRES-Neo转入感受态菌株中，扩增培养，最后抽提感受态菌株的质粒；所述Xhol酶切 位点序列为：CTCGAG ;BamHI酶切位点序列为：GGATCC。2. 根据权利要求1所述的免疫复合物吸附细胞及其制作方法，其特征在于，步骤（1.2) 中所述的PCR反应的体系为：2μ 1 PCR缓冲液，2μ llOmM dNTP和0. 25U exTaq聚合酶；PCR 扩增程序：先941：、3〇8,581：、3〇8,741：、5〇8,35个循环；然后721：，1〇1^11。3. 根据权利要求1所述的免疫复合物吸附细胞及其制作方法，其特征在于，所述Clq、 C3b和C3d受体基因，分别在基因上游引物序列的5'端加入了 Xhol酶切位点，在下游引物 序列5'端加入了 BamHI酶切位点。4. 根据权利要求1所述的免疫复合物吸附细胞及其制作方法，其特征在于，所述Xhol 酶切位点和BamHI酶切位点分别对应载体pLVX-IRES-Neo的两个相同的酶切位点。5. 根据权利要求1所述的免疫复合物吸附细胞及其制作方法，其特征在于，所述病毒 包装制作的步骤为： (2. 1)293FT细胞培养 293?1'细胞用含10%灭活胎牛血清的01^11培养基，在371：饱和湿度、含5%〇)2的孵 箱中培养； 用0. 25%胰蛋白酶消化对数生长期的293FT细胞，以含10%血清的培养基调整细胞密 度为1. 07个细胞，重新接种于10cm细胞培养皿内，37°C、5% C02培养箱内培养，待细胞汇合 度达90%时即可用于转染； (2. 2)转染293FT细胞 (2. 2. 1)转染前2小时，更换新鲜不含双抗的含10% FBS的完全培养基； (2. 2. 2)向一灭菌离心管中加入所制备的三种DNA溶液，按照10 μ g，6. 5 μ g，3. 5 μ g， 2· 5 μ g 的分别把 pLVX-IRES-Neo 加入到 1500 μ L OPTI-MEM 内混匀； (2· 2· 3)将 Lipo2000 试剂轻轻摇匀，取 35 μ L Lipo2000 加入到 1500 μ L OPTI-MEM 内 混匀，两者迅速混合； (2. 2. 4)混合后，室温静止15分钟，以便形成以DNA与Lip〇2000稀释液的转染复合物； (2. 2. 5)将DNA与Lipo2000稀释液的转染复合物逐滴加入到培养皿内，在37°C饱和湿 度、含5%0)...

【专利技术属性】
技术研发人员：易银沙，张万明，朱海强，邹义洲，许澎，刘彩云，袁炳秋，吴小宁，
申请(专利权)人：长沙赢润生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43