一种虫生真菌抗菌肽的制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种虫生真菌抗菌肽制品及其制备方法和应用，本发明专利技术的虫生真菌抗菌肽制品选用虫生真菌蝉花虫草为原料，优化的发酵培养液发酵培养后，经纱布过滤除菌丝后离心收集上清；上清旋转蒸发浓缩后乙醇沉淀去多糖，去除多糖的上清经硫酸铵盐析收集沉淀。沉淀溶于灭菌水后经SephadexG-15柱层析、DEAE-SepharoseFF阴离子交换层析和SephadexG-50柱层析纯化后得到虫生真菌抗菌肽制品。该抗菌肽制品主要是一些分子量小于5.8kDa的小分子肽类。产品为淡黄色粉末状，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等具有抑菌活性。本发明专利技术具有简便快速，制备的抗菌肽纯度高、活性强的特点。制备的抗菌肽制品可广泛应用于医药原料、食品、果蔬防腐保鲜以及饲料添加剂和护肤品等领域。

【技术实现步骤摘要】
一种虫生真菌抗菌肽的制备方法和应用
本专利技术涉及一种虫生真菌抗菌肽制品及其制备方法和应用。本专利技术涉及生物活性物质分离纯化的

技术介绍
青霉素等抗生素的发现给病原菌感染性疾病的治疗带来了革命性飞跃。与此同时人们也意识到病原微生物将最终会产生抗性。但令人惊讶的是病原菌抗性产生的速度和抗性的广泛性。近年来，在临床治疗中结构新颖的抗生素发现匾乏，抗药菌群迅猛发展，使某些感染性疾病成为临床治疗的难题。抗生素、化学防腐剂作为病原菌抑制剂添加到食品、饲料和化妆品中由来已久。但随着抗生素和化学防腐剂的广泛使用和人们对食品质量和环境质量的要求不断提高，它们的副作用也就日益表现出来，面临着被淘汰的局面。据美国卫生基金会和国家癌症研究所新公布的一份报告表明在全世界每年罹患癌症的500万人中，有50％左右与食品污染有关，而其中有30％左右受害于食品中的抗生素或化学防腐剂。为了应对以上种种问题，人们在不断研究和开发新型天然抗菌药物和抗菌防腐添加剂。近年来出现的抗菌肽就是一类具有巨大发展潜力的新型抗菌药物、食品防腐保鲜添加剂和饲料添加剂。抗菌肽是一类小分子阳离子肽类生物活性物质，广泛存在微生物、植物、动物及人体内。到目前为止，已从生物界分离得到800多种抗菌肽。虽然抗菌肽具有广泛的抗性(抗细菌、真菌、病毒、原虫等活性)，但是对正常的哺乳动物细胞无毒性。抗菌肽并不诱发抗性突变的产生，多数抗菌肽的水溶性较好，对热稳定，对较大离子强度、较低或较高的pH都有较强的耐受性。因而抗菌肽可以作为医用和食品方面抗菌性的抗生素的替代药物或添加剂。抗菌肽的开发与应用研究已成为国内外研究的热点。基于抗菌肽的重要作用，许多学者开展新型抗菌肽的寻找及制备研究。寻找和制备抗菌肽有三种途径：化学合成，生物工程(重组技术)和从生物中筛选天然的抗菌肽类。化学合成常受到合成起始点的基础结构的限制。生物工程也存在如不正确转录而导致折叠不准确的蛋白质等问题。从生物中筛选抗菌肽具有来源丰富、物质天然等优点，因而倍受抗菌肽研究工作者的青睐。微生物在人类的生产和生活中具有广阔的应用范围，如治疗药物、精细化工、农用药物、发酵及食品工程等。近年来微生物来源的生物抗菌物质已经逐步得到开发和利用，这些抗菌物主要来源于细菌、真菌及放线菌。真菌是由不同进化途径的类群组成，现已发现69000种。真菌被用作药物，在我国已有悠久的历史，它不仅是我国天然药物资源和中草药的一个极为重要的组成部份，而且已成为当今探索和发掘新药的重要领域。目前国内外学者已经发现了许多具有新颖结构和抗菌活性的真菌抗菌活性物质，主要包括萜类及其皂苷、生物碱类、芳香类、甾体类、酚类和酚酸类以及肽类等。这些抗菌物质多为从植物内生真菌中分离纯化出来的，而从虫生真菌中分离报道的则还没有。虫生真菌是指那些在正常生理条件下就能直接侵入寄主体内，增殖和快速引起死亡以及一些不引起昆虫致命疾病,但可降低寄主活力并使其衰弱的真菌类群。虫生真菌种类多，数量大，代谢类型复杂，可以产生多种生理功能特异的生物活性物质，这种代谢产物的多样性为人类开发新的药品及其它领域的利用提供了重要的新资源途径。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题与不足，本专利技术的目的在于提供一种虫生真菌抗菌肽制品及其制备方法和应用。本专利技术具有制备的抗菌肽纯度高、活性高的特点。本专利技术的目的通过以下技术方案予以实现：本专利技术提供了一种虫生真菌抗菌肽制品的制备方法：本专利技术选用虫生真菌蝉花虫草为原材料，优化的发酵培养液发酵培养后，经纱布过滤除菌丝后离心收集上清；上清旋转蒸发浓缩后乙醇沉淀去多糖，去除多糖的上清经硫酸铵盐析收集沉淀。沉淀溶于灭菌水后经柱层析纯化后得到虫生真菌抗菌肽制品。在一些优选的方式中，本专利技术使用的虫生真菌为保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCCNO.8989的蝉花虫草(Ophiocordycepssobolifera)022007-9号菌株。蝉花虫草又被称作为蝉拟青霉，是一种虫生真菌。在另一些优选的方式中，一种从保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCCNO.8989的蝉花虫草(Ophiocordycepssobolifera)022007-9菌株提取抗菌肽的方法，包括：(1)菌种活化及种子制备：挑取保藏菌株的成熟孢子在PSA斜面上培养，25±1℃活化7～10d。用灭菌蒸馏水加入斜面中，将孢子冲洗下来，用力震摇3～5min，制成孢子悬浮液(种子)，血球计数法计算孢子浓度待用；(2)发酵培养：将孢子浓度为6×107的孢子悬浮液1毫升接种到筛选出的250毫升的发酵培养液中，摇床转速120rpm，25±1℃条件下培养7d；其中，所述的发酵培养液的为：蛋白胨5g/L，蔗糖20g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，溶剂为蒸馏水。(3)发酵液的处理：经过步骤(2)发酵的发酵液经双层纱布过滤除菌丝后，在4℃下，12000rpm离心30min除去发酵液中较大颗粒物质；按10︰1体积比加入无水乙醇，64℃下旋转蒸发浓缩至50倍；按1︰3体积比加入无水乙醇，充分搅拌后，在4℃冰箱内静置过夜沉淀多糖，后在4℃下，12000rpm/min离心30min；收集上清，64℃下旋转蒸发至干后用灭菌蒸馏水重溶；其中纱布的孔径为100目。(4)硫酸铵盐析：将步骤(3)用灭菌蒸馏水重溶后的样品在4℃条件下缓慢加入固体硫酸铵，边加边搅拌使硫酸铵的饱和度达到60％，搅拌半个小时，静置过夜，后在4℃下，12000rpm离心30min；最后收集沉淀；沉淀溶于灭菌蒸馏水中，经0.45μM膜过滤后，保留滤过液；(5)将经过步骤(4)溶于灭菌蒸馏水的沉淀进行SephadexG-15柱层析、DEAE-SepharoseFF阴离子交换层析和SephadexG-50柱层析分离纯化得到所述的虫生真菌抗菌肽制品。一些优选的方式中，所述的SephadexG-15柱层析方法是：将上述溶于灭菌蒸馏水的(1mL)沉淀上样于SephadexG-15柱(2.6×10cm)，以纯水作为流动相洗脱，流速4mL/min，检测波长为280nm，收集第II个峰组分获得的样品II，冷干后低温下冻存。在一些优选的方式中，所述的DEAE-SepharoseFF阴离子交换层析是：将经过SephadexG-15柱层析后活性峰样品(II)1mL上样于DEAE-SepharoseFF阴离子交换柱(2.6×10cm)，流速3mL/min，检测波长280nm。分别以0.05、0.1、0.3、0.5和1mol/LNaCl缓冲液(pH6.5)进行洗脱，收集第1峰组分获得得样品1，冷干后低温冻存。在一些优选的方式中，所述的SephadexG-50柱层析是将1mL生物上述样品1上样于SephadexG-50柱(1.6×30cm)，以0.05mol/LNaCl缓冲液(pH6.5)作为流动相洗脱，流速0.4mL/min，检测波长为280nm，收集所示标记为G1组分。冷干后即为所述的虫生真菌抗菌肽制品，低温冻存。本专利技术提供的上述制备方法制备的虫生真菌抗菌肽制品，是由分子量较小的肽类组成的，主要是一些分子量小于5.8kDa的小分子肽类，外在形态表现为淡黄色粉末状。本专利技术还提供了一种虫生真菌抗菌肽制品作为原料本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从虫生真菌制备抗菌肽制品的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： （1）、菌种活化及种子制备：挑取保藏菌株的成熟孢子在PSA斜面上培养，25±1℃活化7～10d；用灭菌蒸馏水加入斜面中，将孢子冲洗下来，用力震摇3～5min，制成孢子悬浮液，血球计数法计算孢子浓度待用；其中，所述的菌株为保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.8989的蝉花虫草（Ophiocordyceps sobolifera）022007‑9号菌株；  （2）、发酵培养：将孢子浓度为6×107的孢子悬浮液1毫升接种到250毫升的发酵培养液中，摇床转速120rpm/min，25±1℃条件下培养7d；其中，所述的发酵培养液的组成为：蛋白胨5g/ L，蔗糖20g/ L， KH2PO4 1g/ L， MgSO4•7H2O 0.5g/ L，溶剂为蒸馏水； （3）、发酵液的处理：经过步骤（2）发酵的发酵液经双层纱布过滤除菌丝后，在4℃下，12 000 rpm／min离心30 min除去发酵液中较大颗粒物质；按10︰1体积比加入无水乙醇，64℃下旋转蒸发浓缩至50倍；按1︰3体积比加入无水乙醇，充分搅拌后，在4℃冰箱内静置过夜沉淀多糖，后在4℃下，12 000 rpm／min离心30min；收集上清，64℃下旋转蒸发至干后用灭菌蒸馏水重溶；其中纱布的孔径为100目； （4）、硫酸铵盐析：将步骤（3）用灭菌蒸馏水重溶后的样品在4℃条件下缓慢加入固体硫酸铵，边加边搅拌使硫酸铵的饱和度达到60%，搅拌半个小时，静置过夜，后在4℃下，12 000 rpm／min离心30min；最后收集沉淀；沉淀溶于灭菌蒸馏水中，经0.45μM膜过滤后，保留滤过液。...

【技术特征摘要】
1.一种从虫生真菌制备抗菌肽制品的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)、菌种活化及种子制备：挑取保藏菌株的成熟孢子在PSA斜面上培养，25±1℃活化7～10d；用灭菌蒸馏水加入斜面中，将孢子冲洗下来，用力震摇3～5min，制成孢子悬浮液，血球计数法计算孢子浓度待用；其中，所述的菌株为保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCCNO.8989的蝉花虫草(Ophiocordycepssobolifera)022007-9号菌株；(2)、发酵培养：将孢子浓度为6×107的孢子悬浮液1毫升接种到250毫升的发酵培养液中，摇床转速120rpm，25±1℃条件下培养7d；其中，所述的发酵培养液的组成为：蛋白胨5g/L，蔗糖20g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，溶剂为蒸馏水；(3)、发酵液的处理：经过步骤(2)发酵的发酵液经双层纱布过滤除菌丝后，在4℃下，12000rpm离心30min除去发酵液中较大颗粒物质；按10︰1体积比加入无水乙醇，64℃下旋转蒸发浓缩至50倍；按1︰3体积比加入无水乙醇，充分搅拌后，在4℃冰箱内静置过夜沉淀多糖，随后在4℃下，12000rpm离心30min；收集上清，64℃下旋转蒸发至干后用灭菌蒸馏水重溶；其中纱布的孔径为100目；(4)、硫酸铵盐析：将步骤(3)用灭菌蒸馏水重溶后的样品在4℃条件下缓慢加入固体硫酸铵，边加边搅拌使硫酸铵的饱和度达到60％，搅拌半个小时，静置过夜，随后在4℃下，12000rpm离心30min；最后收集沉淀；沉淀溶于灭菌蒸馏水中，经0.45...

【专利技术属性】
技术研发人员：党向利，柴一秋，厉晓腊，刘又高，金轶伟，陈官菊，潘益虎，
申请(专利权)人：浙江省亚热带作物研究所，
类型：发明
国别省市：浙江;33