用于纯化单克隆抗体的结晶方法技术

本公开涉及从无细胞培养物上清中结晶抗体的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于纯化单克隆抗体的结晶方法相关申请本申请要求2012年5月11日提交的美国临时申请序列号61/645,855的优先权。
本公开涉及结晶和纯化单克隆抗体的方法。专利技术背景本公开涉及直接从培养物上清(如细胞培养物的无细胞上清，所述培养物分泌抗体到上清中)高产率制备和纯化晶体形式的单克隆抗体。蛋白结晶的问题包括例如：1)需要专用设备；2)生成多形态晶体；3)需要接种以起始结晶；4)耗时的工艺(如60-80小时)；5)结晶前的色谱步骤(如蛋白A、离子交换(IEX)；7)使用不利的添加剂和/或赋形剂(如聚乙二醇)；和8)存储困难。尽管单克隆抗体先前从细胞培养物上清中直接结晶，但产率较低。另外，之前的方法需要使用添加剂如聚乙二醇。令人惊讶地，本文所述方法可从无细胞培养物上清高产率生成高纯度、结晶的单克隆抗体，而不需使用昂贵的步骤或设备。这些新方法提供许多优势，包括例如适于配制成药物产品的高浓缩、稳定结晶抗体以及显著的时间和成本效益。附图简要说明图1.示例性结晶方法。图2A-C.示例性结晶条件。图3A-B.示例性晶体。图4.示例性条件下pH对结晶的影响。图5.示例性条件下的结晶动力学。图6.额外示例性条件下的结晶动力学。图7A和B.示例性晶体。图8.示例性晶体。图9.示例性晶体。图10.示例性晶体。图11.示例性晶体。
技术实现思路
本公开涉及解决单克隆抗体纯化中通常所遇到问题的专利技术方法。令人惊讶地，本文所述方法用于从含单克隆抗体的混合物中提供纯化单克隆抗体制品。在一些实施方式中，本文所述专利技术方法可直接从无细胞培养物上清中高产率生成高纯度、结晶的单克隆抗体。在本文所述特定实施方式中，这通过使用低离子强度缓冲液完成。在一些实施方式中，所述制备晶体形式单克隆抗体的方法可包括在促进沉淀的合适pH条件下将低离子强度缓冲液引入含单克隆抗体的无细胞培养物上清。然后，通常移出所得主要含杂质的沉淀物(如，由此生成澄清的上清)。随后，任选地，浓缩所述澄清的上清。接着可引入合适缓冲液以生成预处理溶液。之后，该预处理溶液的pH可处于或调整至蛋白结晶的合适水平(如，对于在pI6.8或附近结晶的蛋白，pH应为约6.8)。还可包括一种或多种添加剂(如氯化钠、聚乙二醇、糖)。所得晶体可随之通过例如离心来分离。图1描述某些实施方式。一些实施方式提供了包含存在于初始无细胞培养物上清中的至少约50％、75％、80％、85％、90％、95％或99％蛋白(如抗体)的产品。使用前，所述晶体可溶于合适溶液，然后任选地，通过调整溶液pH至蛋白结晶的范围(如对于在pI6.8或附近结晶的蛋白，pH应为约6.8)再结晶。例如，通过调整细胞培养物上清的起始蛋白浓度和/或以特定速度搅拌任何步骤的底物，可控制所得晶体的大小。还提供含结晶抗体的组合物和再溶解抗体。本专利技术方法可没有色谱步骤。从一个或多个专利技术方法步骤去除色谱的优势包括生成晶体形式的纯化单克隆抗体的时间显著减少。本专利技术的特定实施方式包括对所述步骤的原料或直接产品没有实施色谱的那些实施方式。本专利技术的特定实施方式包括在结晶步骤前没有实施色谱的那些实施方式。专利技术详述如上所简要描述和下面更详细描述，本公开涉及纯化单克隆抗体的方法。令人惊讶地，本文所述方法可用于从含单克隆抗体的组合物中提供纯化单克隆抗体制品。如上所述，这通过使用低离子强度缓冲液完成。在一些实施方式中，本文所述专利技术方法可直接从无细胞培养物上清中高产率生成高纯度、结晶的单克隆抗体。在一些实施方式中，所述制备晶体形式单克隆抗体的方法可包括一个或多个以下步骤：提供含单克隆抗体的无细胞培养物上清，将低离子强度缓冲液以足以促进所述抗体结晶的量引入(如稀释或置换(例如通过部分或完全透析))无细胞培养物上清，调整所得溶液的pH以生成晶体，以及分离晶体，其中分离所述无细胞培养物上清中含有的至少50％抗体。在一些实施方式中，所述制备晶体形式单克隆抗体的方法可包括一个或多个以下步骤：测定抗体在低离子强度缓冲液中结晶的pH范围，将所述缓冲液以足以促进所述抗体在该pH范围内结晶的量引入(如稀释或置换(如通过部分或完全透析))细胞培养物上清从而生成预结晶溶液，调整所述预结晶溶液的pH到上面测定步骤的测定范围以生成晶体，以及分离晶体，其中分离所述无细胞培养物上清中含有的至少50％抗体。在一些实施方式中，所述制备晶体形式单克隆抗体的方法可包括一个或多个以下步骤：a)获得生成单克隆抗体的杂交瘤的无细胞培养物上清，且任选地，将其浓缩；b)用缓冲液(如低离子强度缓冲液)透析上清以提供合适pH；c)从所述上清移除步骤b)形成的沉淀物(若存在)以生成澄清的上清；d)任选地，浓缩所述澄清上清；e)任选地，用合适缓冲液透析c)或d)的澄清上清以生成预处理溶液；f)从步骤e)的预处理溶液移除沉淀物(若存在)；g)调整步骤e)或f)的预处理溶液的pH至单克隆抗体结晶的合适水平(如对于在pI6.8或附近结晶的单克隆抗体，pH应为约6.8)，和任选地，引入一种或多种添加剂以生成结晶溶液；和h)通过例如离心来分离步骤g)形成的晶体。尽管单克隆抗体先前从细胞培养物上清中直接结晶，但产率较低。之前的方法通常需要使用添加剂如聚乙二醇。标准结晶筛选一般不包括低离子强度缓冲液。pH对蛋白溶解度的影响极高(其可能降低过饱和的可能性)。如本文所示(如实施例)，含低离子强度缓冲液的蛋白溶液的简单pH变化能令人惊讶地用于降低单克隆抗体溶解度(例如，从pH5的>200gL-1到pH6.8的0.3gL-1)，进而引起极高的过饱和及结晶(如，在pH6.8无沉淀)，在pH5(在该点抗体可溶)有杂质沉淀(其中一些能抑制结晶)。令人惊讶地，本文所述方法可直接从无细胞培养物上清中高产率生成高纯度、结晶的单克隆抗体。图1描述某些实施方式。在某些实施方式中，可浓缩步骤a)产生的澄清上清。在一些实施方式中，pH可用缓冲液调整，所述缓冲液任选地包括一种或多种选自氯化钠、聚乙二醇和糖的添加剂。令人惊讶地，一些实施方式提供的产品包括例如上面步骤a)的初始无细胞培养物上清中存在的至少约50％、75％、80％、85％、90％、95％或99％抗体(如高产率)。使用前，所述晶体可溶于合适溶液(如药物组合物)。所述晶体还能溶解且随后任选地再结晶，例如通过调整溶液pH到合适水平(如对于pI约6.8的单克隆抗体，pH应为约6.8)。这些方法中，例如通过调整细胞培养物上清的起始蛋白浓度和/或以特定速度搅拌任何步骤的底物，可控制所得晶体的大小。下面描述这些方法的其他细节、所生成产物和所述产物的应用。本文所述方法通常起始于细胞的无细胞培养物上清，其生成待结晶的单克隆抗体(如步骤a))。应理解还可使用其它原料(如杂交瘤培养物，腹水，含待结晶抗体的半纯化或纯化制品)。这些方法还能适于从血清等分离“纯化的”多克隆抗体。关于无细胞培养物上清，其可从培养物中直接使用(如直接)或在加工前进行浓缩。例如，所述无细胞培养物上清可浓缩约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20倍以提供更小体积和因而更高蛋白(和其它组分)浓度(例如，100ml到10ml，倍数为10，或10:1)。例如，所述无细胞上清的浓度可为约本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备晶体形式的单克隆抗体的方法，所述方法包括：a)提供包含单克隆抗体的无细胞的细胞培养物上清，b)将低离子强度缓冲液以足以促进所述抗体结晶的量引入该无细胞的细胞培养物上清，c)调整所述预结晶溶液的pH以生成晶体，和d)分离步骤c)形成的晶体，其中在步骤d中分离所述无细胞的细胞培养物上清中含有的至少50％抗体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.05.11 US 61/645,8551.一种制备纯化的单克隆抗体的方法，所述方法包括：a)向包含单克隆抗体的组合物中引入低离子强度缓冲液，其中杂质从所述组合物中沉淀，且其中所述低离子强度缓冲液的pH处于所述抗体可溶且不结晶或沉淀的pH，且其中所述低离子强度缓冲液提供小于或等于12mScm-1的传导率；b)移除沉淀物以生成第一澄清组合物；c)任选地，向所述澄清组合物中引入低离子强度缓冲液，其中杂质从所述组合物中沉淀以生成第二澄清组合物，且其中所述低离子强度缓冲液的pH处于所述抗体可溶且不结晶或沉淀的pH；d)移除来自步骤c)组合物的沉淀物；e)调整所述第一或第二澄清组合物的pH到大约单克隆抗体的pI和任选地引入一种或多种添加剂以生成晶体；和f)分离步骤e)中形成的晶体。2.如权利要求1所述的方法，其中所述包含单克隆抗体的组合物为包含单克隆抗体的无细胞的细胞培养物上清，且其中步骤a)和c)分别包括用低离子强度缓冲液透析所述无细胞的细胞培养物上清或澄清上清，且其中在步骤a)和b)之间和/或步骤b)和c)之间任选地浓缩所述上清。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述低离子强度缓冲液提供4mScm-1或更小的传导率。4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述低离子强度缓冲液提...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·赫克马特，B·赫尔克，H·K·舒尔茨，B·斯梅杰卡尔，
申请(专利权)人：诺华股份有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH