一组特异识别宋内氏志贺氏菌的寡核苷酸适配子制造技术

本发明专利技术公开了一组特异性识别宋内氏志贺氏菌的寡核苷酸适配子Sp1、Sp20，是通过Cell-SELEX技术以完整的宋内氏志贺氏菌细胞作为靶标对体外合成的随机单链寡核苷酸文库进行筛选、扩增、酶切、测序、亲和力和特异性分析得到的，属于食品安全分子生物领域。筛选获得的适配子具有高亲和性和特异性、性质稳定、体外合成方便且成本低等特点，能通过标记功能基团或荧光染料运用于食品中宋内氏志贺氏菌的检测，为现今依赖抗体的检测方法提供了新的选择。

【技术实现步骤摘要】
一组特异识别宋内氏志贺氏菌的寡核苷酸适配子
本专利技术涉及食品安全生物
，特别涉及到利用分子生物学技术中的SELEX技术(指数富集的配体系统进化技术)筛选一组与宋内氏志贺氏菌高特异亲和的寡核苷酸适配子，为该核酸适配子在检测食品中宋内氏志贺氏菌的应用提供科学依据和理论基础。
技术介绍
志贺氏菌是一种具有高度传染性和危害严重的革兰氏阴性肠道致病菌。在发展中国家，由志贺氏菌引起细菌性痢疾的重大卫生事件时常发生，尤其夏秋两季最为常见，每年约有1.6亿个感染病例，约100万死于细菌性痢疾。志贺氏菌主要是经口感染，色拉、生的蔬菜、奶和奶制品、禽、水果、饮水、面包制品等易被污染。志贺氏菌能分泌强烈的内毒素和外毒素，引起发冷、发热、腹泻、里急后重、排粘液脓血样大便、神志障碍、甚至中毒性休克等症状。而宋内氏志贺氏菌是志贺氏菌中对外界环境抵抗力最强，分布较广的一类菌型，因此建立快速、灵敏、准确地检测宋内氏志贺氏菌的检测方法至关重要。现今，用于宋内氏志贺氏菌的检测包括传统的生物学检测、分子生物检测、免疫学检测方法。传统的细菌培养和生化鉴定耗时，操作繁琐；分子生物学检测比如PCR方法虽然快速、准确，但是易受操作条件影响其特异性；免疫学检测具有特异性强、准确、灵敏的特点，但制备特异性抗体的过程耗时复杂，制备出的抗体也易受温度等环境因素的影响。适配子是通过SELEX技术从体外合成的随机寡核苷酸单链文库中筛选而得，能够以特定的结构与靶标高特异亲和的一段较短的单链DNA序列或RNA序列。如今，适配子已经广泛地应用于如靶标检测、酶抑制，受体调节和药物传递等各种领域。适配子相比抗体表现出极大的优势，除了具有较高的特异亲和性；适配子筛选完全在体外进行，筛选周期短，合成方便且成本低，同时易标记一些功能基团和报告分子；适配子变性与复性可逆且速度快，稳定好，受环境条件影响小，可长期保存。随着SELEX技术的不断完善进步，适配子已经广泛用于不同的靶标，如小分子物质(有机染料，金属，药物，氨基酸，核苷酸和肽等)、蛋白质(包括酶、抗体、基因调控因子，以及外源凝集素)、肿瘤细胞、病毒和致病菌等。Cell-SELEX筛选是一种基于完整细菌细胞为靶物质的筛选方法，将细菌悬浮液通过离心沉淀从而分离出结合和未结合的寡核苷酸分子。近几年，已成功采用Cell-SELEX技术筛选出大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌等细菌的适配子，基于Cell-SELEX技术筛选病原致病菌、肿瘤细胞等细胞的适配子已经成为当前的研究热点。本专利技术以引起肠道传染病的宋内氏志贺氏菌为靶标，采用Cell-SELEX技术筛选出宋内氏志贺氏菌的高特异亲和的适配子，稳定性高、合成方便、易标记功能基团和报告分子，将广泛应用于食品中宋内氏志贺氏菌的快速检测。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种微生物的分子生物学检测方法，特别涉及一种利用适配子技术快速、准确检测宋内氏志贺氏菌的方法。本专利技术方法利用指数级富集配体的系统进化技术(SELEX技术)，以宋内氏志贺氏菌完整的菌细胞为靶标，筛选获得2条与靶细胞高亲和性特异结合的适配子Sp1、Sp20，可以通过荧光基团标记方法将获得的适配子转为报告适配子，用于食品中宋内氏志贺氏菌的检测，达到快速、准确诊断的目的。本专利技术的优点：(1)与抗体相比，适配子可在体外筛选，筛选周期短，合成方便，易标记各种功能基团和报告分子，性质稳定，可长期保存使用。(2)该组序列是从结构显著、与宋内氏志贺氏菌结合具有不同亲和力的9条适配子序列中选取出的亲和力和特异性均较强的一组适配子序列，能够特异识别宋内氏志贺氏菌。附图说明图1是宋内氏志贺氏菌9个适配子家族代表性序列的二级结构图谱。图2是宋内氏志贺氏菌适配子Sp1、Sp20、Sp22、Sp23亲和力饱和结合曲线。图3是宋内氏志贺氏菌适配子Sp1、Sp20、Sp22、Sp23的特异性图。表1是宋内氏志贺氏菌适配子解离常数。具体实施方式：下面是通过Cell-SELEX技术筛选高特异亲和的宋内氏志贺氏菌核酸适配子及其快速检出宋内氏志贺氏菌方面的应用。1、合成随机单链DNA文库和引物(IDT公司合成)随机单链DNA文库：5′-TGAGCCCAAGCCCTGGTATG-N40-GGCAGGTCTACTTTGGGATC-3′，构建了长度为80nt的随机ssDNA文库，两端为固定引物序列，中间为40个碱基的随机序列，库容量达到1014以上；上游引物：5′-TGAGCCCAAGCCCTGGTATG-3′；5′端磷酸化下游引物：5′-(phosphate)-GATCCCAAAGTAGACCTGCC-3′，将随机ssDNA文库和两种引物均用TE缓冲液配制成100μmol/L贮存液-20℃贮存备用。2、筛选所用宋内氏志贺氏菌的获取与处理LB液体培养基培养宋内氏志贺氏菌，37℃摇床过夜培养。1.0×108cfu/mL浓度的菌液1mL，在4℃，3500rpm下离心3min，弃上清，用结合缓冲液BB(50nMTric-HCl，5nMKCl，100nMNaCl，1nMMgCl2，PH＝7.4)冲洗两次，洗去培养基成分，置4℃环境储存备用。3、Cell-SELEX技术筛选适配子第一轮筛选时，反应体系为600μL，取2nmol扩增后的随机ssDNA文库加入BB缓冲液于95℃变性10min，立即0℃冷却10min，再加入处理好的菌细胞离心管内。为降低结合背景，体系中再加入10倍于随机ssDNA文库摩尔数的0.5％BSA溶液和tRNA，于37℃孵育1h。孵育后更换离心管，以除去与离心管壁结合的ssDNA，然后在4℃，5000rpm离心5min，弃上清，去除未结合或结合不紧密的ssDNA。随后用BB结合缓冲液清洗2次，悬于100μL1×PCR缓冲液中，在95℃变性10min，0℃立即冷却10min，再经4℃，5000rpm离心5min解离下结合的ssDNA，吸取上清即为第一轮筛选所得的ssDNA适配子，并以此为模板进行PCR扩增。50μLPCR体系包括2μLssDNA模版，1μL上游引物(20μmol/L)，1μL下游引物(10μmol/L)，1μLdNTP(5mmol/L)，0.5μLTaqDNA聚合酶(5U/μL)，5μL1×PCRBuffer，39.5μL超纯水。热循环参数为94℃变性5min，接着94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s，进行19轮循环，然后72℃延伸1min，最后12℃冷却2min。PCR产物采用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，采用Gelred染色后置于紫外光下验证PCR产物dsDNA大小为80bp。最后PCR产物采用酚—氯仿方法提纯。为获得下一轮筛选ssDNA文库，PCR产物dsDNA采用Lambda核酸外切酶酶切5′端磷酸基团修饰的DNA链。酶切在37℃反应30min，75℃下灭酶10min，再采用8％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳验证酶切完全。酚—氯仿方法提纯后的ssDNA用于第二轮筛选的文库。第二轮至第十二轮反应体系为350μL，其中随机ssDNA文库为100pmol。筛选每增加一轮，加入BSA和tRNA溶液的摩尔数增大一倍，直至增大至8倍。为提高筛选适配子的特异性，每三轮采用痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌、鼠本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组特异性识别宋内氏志贺氏菌的寡核苷酸适配子，其特征在于寡核苷酸适配子序列如序列表中序列1，2所示的序列。

【技术特征摘要】
1.一组特异性识别宋内氏志贺氏菌的寡核苷酸适配子，其特征在于寡核苷酸适配子序列如序列表中序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：王周平，巩文慧，段诺，吴世嘉，夏雨，马小媛，郭晓飞，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32