一种DNA捕获探针的制备方法及应用技术

本发明专利技术提供一种DNA捕获探针的制备方法及应用，采用了扩增目的基因-随机打断-生物素标记的探针制备方法，利用随机覆盖的设计思路取代了传统的瓦片式覆盖，与传统探针制备方法中合成大量DNA覆盖目标区域相比，本发明专利技术仅需合成目标区域的扩增引物，避免了直接合成探针造成的成本上升问题，因而大大降低了制备成本且捕获的灵敏性与特异性与传统探针制备方法制备的探针相比没有差异。

【技术实现步骤摘要】
一种DNA捕获探针的制备方法及应用
本专利技术属于核酸探针制备领域，具体涉及一种DNA捕获探针的制备方法及应用。
技术介绍
传统桑格测序利用DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止。每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的不同颜色荧光标记的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过毛细管电泳分离大小不同的片段，观察不同大小片度的荧光标记来推断序列。第二代测序技术主要采用边合成边测序的方法，首先利用超声波把待测的DNA样本打断成小片段，并在这些小片段的两端添加上不同的接头，构建出单链DNA文库。这些文库中的接头附着在固相表面，并在表面进行桥式PCR扩增。经过不断的扩增和变性循环，最终每个DNA片段都在各自位置上集中成束，每一个束都含有单个DNA模板的很多份拷贝，进行这一过程的目的在于实现将碱基的信号强度放大，以达到测序所需的信号要求。测序反应过程中，向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4种dNTP(如同Sanger测序法)。这些dNTP的3’-OH被化学方法所保护，因而每次只能添加一个dNTP。在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。接着，再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，并由光学设备完成荧光信号的记录，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。这样荧光信号记录完成后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP3’-OH保护基团，以便能进行下一轮的测序反应。自2005年诞生以来，第二代测序技术展示了广阔的应用前景。通过测序科学家可以看到单核苷酸多态性、突变热点、基因组结构变异、群体多态性等重要信息。在进化领域科学家通过群体多态性分析探索物种之间的进化模式；在微生物领域DNA测序分型已被证明快捷而准确；而在医学领域基因组重测序在发现SNP与重大疾病的关系方面有着重要的意义。由于往往只对基因组特定区域(比如外显子组)而不是全基因组感兴趣，因此会利用基因捕获探针对特定的区域进行捕获，对捕获出的DNA序列进行测序。探针制备是捕获测序中关键环节，目前常用的探针制备方法主要采取“瓦片式覆盖设计，人工合成碱基”的方式。具体方法是：针对感兴趣的区域设计一定长度的探针序列，每个序列沿着基因位置移动一定距离。然后采用人工合成的方式大量合成上述序列。典型的代表有中国专利《一种线粒体病基因的筛查方法》(CN101270390A)，针对感兴趣的区域中的非重复区域设计60bp的探针序列，每个序列沿着基因位置挪动设计，探针之间挪动3bp，实现对目标区域的瓦片式覆盖；然后采用原位合成技术大量合成探针。另外文献[CalvoSE,ComptonAG,HershmanSG,LimSC,LieberDS,TuckerEJ,LaskowskiA,GaroneC,LiuS,JaffeDBetal:Moleculardiagnosisofinfantilemitochondrialdiseasewithtargetednext-generationsequencing.Sciencetranslationalmedicine2012,4(118):118ra110]中也采用了类似的思路，只是探针长度和挪动距离有所改变。“瓦片式覆盖设计，人工合成碱基”方法最大的缺陷是成本过于高昂，且随着目标区域的增大，探针合成成本急剧上升。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种DNA捕获探针的制备方法及应用，可以降低探针制备成本。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案。一种DNA捕获探针的制备方法，包括以下步骤：(1)针对基因组中感兴趣区域设计特异的扩增引物，利用扩增引物扩增所述感兴趣区域得扩增产物；(2)采用超声处理的方法将所述扩增产物打断为DNA片段；(3)对DNA片段进行生物素标记；(4)经过步骤(3)后，从所述DNA片段中分离得到标记有生物素的DNA单链，得DNA捕获探针。所述感兴趣区域为人线粒体DNA。所述步骤(2)具体包括以下步骤：将扩增产物(回收的人线粒体DNA扩增产物)稀释至10ng/L，然后取100L稀释后的扩增产物放入超声仪中进行超声处理，超声仪的输出功率为1000Hz，超声处理次数为90次，单次超声处理时间为15秒，两次超声处理间间隔15秒。进行生物素标记前，对步骤(2)得到的DNA片段按照片段大小进行纯化，然后进行生物素标记，所述纯化的方法包括以下步骤：向经过步骤(2)处理的100L10ng/L扩增产物中加入核酸纯化磁珠(Ampurebead)后进行混匀，然后静置5min；静置后置于磁架上，待核酸纯化磁珠被吸附后，吸弃上清；然后用70％乙醇洗涤核酸纯化磁珠，洗涤后晾干核酸纯化磁珠，用水重悬晾干后的核酸纯化磁珠后置于磁架上，待核酸纯化磁珠被吸附后，转移上清，该上清中含有纯化后的DNA片段。所述核酸纯化磁珠的加入量为90L(核酸纯化磁珠的加入量决定回收的DNA片段的大小)，70％乙醇的用量为每次洗涤使用500～750L。所述步骤(4)具体包括以下步骤：(a)用亲和素包被的磁珠(invitrogen)吸附生物素标记成功的DNA片段；(b)经过步骤(a)后，用氢氧化钠水溶液洗涤所述亲和素包被的磁珠，将所述DNA片段中未标记生物素的DNA单链从所述亲和素包被的磁珠上去除；(c)经过步骤(b)后，用去离子甲酰胺重悬所述亲和素包被的磁珠并于95℃加热10min，使所述生物素与所述亲和素分离，然后分离得到标记有生物素的DNA单链。所述氢氧化钠水溶液的浓度为1.25mM(碱性太强或太弱均无法达到洗涤的目的)。上述DNA捕获探针的制备方法制备的DNA捕获探针在从人全基因组测序文库中捕获人线粒体DNA文库的应用。DNA捕获探针的用量为所述测序文库质量的2～2.5％。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术采用了扩增目的基因-随机打断-生物素标记的探针制备方法，利用随机覆盖的设计思路取代了传统的瓦片式覆盖，与传统探针制备方法中合成大量DNA覆盖目标区域相比，本专利技术仅需合成目标区域的扩增引物，避免了直接合成探针造成的成本上升问题，因而大大降低了制备成本且捕获的灵敏性与特异性与传统探针制备方法制备的探针相比没有差异。附图说明图1为本专利技术制备的人线粒体DNA捕获探针的捕获效果图，其中，A-D行：本专利技术制备探针的捕获效果(四次重复)，E行：采用传统方法制备的探针的捕获效果。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术作详细说明。(一)人线粒体DNA捕获探针的制备方法，包括以下步骤：1.以三对引物(1F和1R，2F和2R，3F和3R)扩增线粒体DNA全长序列；所述扩增的条件为：(1)PCR反应体系：所用DNA聚合酶为东洋纺KODFX，货号KFX-101。反应体系：(2)PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸8min；40个循环；72℃延伸15min。所述引物的序列如表1所示：表12.将三对引物的扩增产物等摩尔混匀，用超声仪打断成本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种DNA捕获探针的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)针对基因组中感兴趣区域设计特异的扩增引物，利用扩增引物扩增所述感兴趣区域得扩增产物；(2)采用超声处理的方法将所述扩增产物打断为DNA片段；(3)对DNA片段进行生物素标记；(4)经过步骤(3)后，从所述DNA片段中分离得到标记有生物素的DNA单链，得DNA捕获探针。

【技术特征摘要】
1.一种DNA捕获探针的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)针对基因组中感兴趣区域设计特异的扩增引物，利用扩增引物扩增所述感兴趣区域得扩增产物；(2)采用超声处理的方法将所述扩增产物打断为DNA片段将扩增产物稀释至10ng/μL，然后取100μL稀释后的扩增产物放入超声仪中进行超声处理，超声仪的输出功率为1000Hz，超声处理次数为90次，单次超声处理时间为15秒，两次超声处理间间隔15秒；(3)对DNA片段进行生物素标记DNA片段于95℃变性5min后，迅速插入冰上；完全冷却后，加入4μLBiotin-highprime，充分混匀，37℃孵育过夜；(4)经过步骤(3)后，从所述DNA片段中分离得到标记有生物素的DNA单链，得DNA捕获探针；所述感兴趣区域为人线粒体DNA。2.根据权利要求1所述一种DNA捕获探针的制备方法，其特征在于：进行生物素标记前，对步骤(2)得到的DNA片段按照片段大小进行纯化，然后进行生物素标记，所述纯化的方法包括以下步骤：向经过步骤(2)处理的100μL10ng/μL扩增产物中加入核酸纯化磁珠后进行混匀，然后静置5min；静置后置于磁架上，待核酸纯化磁珠被吸附后，吸弃上清；然后用70％乙醇洗涤核酸纯化磁珠，洗涤后晾干核酸纯化磁珠，用水重悬晾干后的核酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢金良，李德洋，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61