基于SNaPshot技术的小鼠肝炎病毒分型检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，涉及一种基于SNaPshot技术的小鼠肝炎病毒分型检测方法及试剂盒。所述的方法包括PCR扩增、PCR产物纯化、单碱基延伸的步骤；所述的试剂盒包括PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂和单碱基延伸反应试剂。本发明专利技术的方法和试剂盒能够简捷、直观、准确的检测小鼠肝炎病毒分型，灵敏度高，临床样本检测的准确性为100%，特异性强，与现有技术相比，快速高效，可应用于临床检测工作。

【技术实现步骤摘要】
基于SNaPshot技术的小鼠肝炎病毒分型检测方法及试剂盒
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及基于SNaPshot技术的小鼠肝炎病毒分型检测方法及试剂盒。
技术介绍
小鼠肝炎病毒（MurineHepatitisVirus,MHV）为RNA病毒，是清洁级及以上级别实验小鼠微生物检测中的必检项目，其主要包括4个常见毒株，即MHV1、MHV3、JHM、A59。MHV感染可引起小鼠病毒性脑炎、病毒性肝炎或病毒性肠炎。国家标准(GB14922.2-2011)规定小鼠每三个月至少检测一次MHV，检测结果为阳性者，将直接淘汰。检测MHV是控制实验小鼠质量的重要举措。不同的MHV毒株因其嗜组织性不同而导致感染小鼠后具有不同的致病性，如MHV1和MHV3为嗜肝性，JHM为嗜神经毒性，A59同时具有嗜神经毒性和嗜肝性。不同的毒株感染小鼠可建立不同的实验动物模型，如MHV3可诱导建立小鼠爆发型或病毒性肝炎模型，A59感染可构建因慢性病毒性肝炎诱发肝组织脂肪变性的动物模型和湿热证小鼠模型。不同的毒株感染将对不同的动物实验产生不同的影响，如在应用仙台病毒诱导淋巴细胞干扰素分泌的研究中，MHV3的感染将增强仙台病毒的易感性，在T细胞缺陷鼠免疫学相关实验研究中，A59感染将导致其巨型胶质细胞、淋巴细胞等清除病毒抗原的能力延迟。建立MHV常见毒株的分型检测技术对保证实验动物质量和动物实验准确性具有重要意义。小鼠肝炎病毒具有潜伏期，发病传播均无明显规律，故极易引起实验动物大范围爆发性感染。目前，用于MHV检测的方法主要有酶联免疫吸附试验、免疫酶试验和免疫荧光试验。此类方法虽然操作简便，但是不适用于免疫缺陷小鼠或处于MHV感染初期的小鼠的检测。最重要的是，现今所能用于MHV检测的方法均不能对MHV常见毒株感染的具体情况进行分型检测。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种基于SNaPshot技术的小鼠肝炎病毒分型检测方法，该方法能够简捷、直观、准确的检测小鼠肝炎病毒分型，MHVcDNA最低检测浓度为1.25ng/µL，灵敏度高；临床样本检测的准确性为100%。本专利技术的目的之二在于提供一种检测小鼠肝炎病毒分型的试剂盒，操作方便快捷，可应用于临床检测工作。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：基于SNaPshot技术的小鼠肝炎病毒分型检测方法，具体包括以下步骤：1）PCR扩增以样本MHV病毒RNA的cDNA为模板进行PCR扩增，得到含有目的基因的PCR产物；所述PCR扩增采用的是序列为SEQIDNo：1和SEQIDNo：2的PCR引物，和/或序列为SEQIDNo：3和SEQIDNo：4的PCR引物；2）PCR产物纯化对步骤1）中得到的PCR产物进行纯化，得到纯化PCR产物；3）单碱基延伸使用单碱基延伸酶、ddNTPs、延伸反应缓冲液和特异性的单碱基延伸引物对步骤2）中得到的纯化PCR产物进行单碱基延伸；延伸完毕后，向反应体系中加入虾碱性磷酸酶SAP处理，得处理液Ⅰ，取处理液Ⅰ，加入Liz120sizestandard内标和Hi-Di甲酰胺处理，得处理液Ⅱ，取处理液Ⅱ进行测序仪电泳分析所述样本的基因型，进而得出样本分型结果；所述特异性的单碱基延伸引物为T1、T2、T3和T4中的一条或多条，所述T1、T2、T3和T4的序列如SEQIDNo：5、SEQIDNo：6、SEQIDNo：7和SEQIDNo：8所示，所述ddNTPs进行荧光标记，所述T1、T2、T3和T4序列中的一个或多个序列的5’端用polyT修饰。本专利技术中，单碱基延伸引物用不同数量的PolyT修饰，经SNaPshot反应，延伸引物后一个碱基而停止，四种碱基用不同颜色荧光标记，经测序仪电泳后，通过位置和颜色组合，可直接判断样本基因型。PCR引物和特异性的单碱基延伸引物详见表1和表2。表1MHVPCR扩增引物表2MHVSNaPshot单碱基延伸引物（无polyT修饰）上述方案中，样本MHV病毒RNA采用常规方法提取，将RNA逆转录为cDNA也采用
常规方法。在本专利技术中，样本病毒RNA的提取采用RNA提取试剂盒，按照其说明进行操作；RNA的逆转录用逆转录试剂盒，按照其说明书进行操作，如逆转录步骤为：取PrimerScript®RTEnzymeMix11µL，OligodTPrimer(50µmol/L)1µL，5×PrimerScript®Buffer(forRealTime)4µL，Random6mers(100µmol/L)4µL，TotalRNA500ng，用RNaseFreedH2O补足20µL。逆转录条件为42ºC×15min，85ºC×5s。上述方案中，所述步骤1）中，所述MHV病毒为MHV1、MHV3、JHM和A59中的一种或多种，所述MHV1、MHV3、JHM、A59病毒的基因序列分别为CGCT、TATT、TGCT、TGTC。MHV1、MHV3、JHM和A59是小鼠肝炎病毒（MurineHepatitisVirus,MHV）为的主要4个常见毒株。上述方案中，所述的PCR产物进行纯化是指用于减少待检体系内其他物质对后续反应的影响的处理步骤。本专利技术的PCR产物纯化有两种方式：一是分离杂质并丢弃，二是使杂质失去活性。其中，切胶纯化、过纯化柱等都是通过电泳、纯化柱等分离杂质，并回收相对较纯的PCR产物，可以认为是第一种纯化方式，该方式一般耗时，操作复杂，特别是样本量大时；虾碱性磷酸酶（SAP）的作用是降解（亦称“消化”）dNTP，使之不能继续作为DNA聚合酶或单碱基延伸酶的底物参与PCR或单碱基延伸反应，从而不干扰后续反应，可以认为是第二种纯化方式。应当指出的是，单独的外切酶ExoI的作用是预先将单链DNA（在反应完成后的PCR产物体系中，主要是剩余的PCR引物）降解成dNTP。上述方案中，所述单碱基延伸，是对上一步PCR的产物进行多重单碱基延伸。在单碱基延伸步骤中，采用不同颜色荧光标记的ddNTP代替dNTP，因此，在延伸一个碱基后，延伸引物将终止延伸。由于“ddNTP”与普通dNTP不同的是，在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基，不能同后续的ddNTP形成磷酸二酯键，因而，延伸引物仅在SNP位点前连接一个ddNTP，单碱基延伸产生的产物是延伸引物仅延伸一个碱基的核苷酸片段，而不能像PCR那样，不断的往下延伸。在本专利技术中，SNaPshot单碱基延伸方法是通过设计4条单碱基延伸引物，分别与4个突变位点之前的碱基序列对应，并修饰不同数量的PolyT，经SNaPshot反应，延伸引物后一个碱基即对应的突变位点而停止，而该碱基被不同颜色荧光标记，经测序仪电泳后，通过位置和颜色组合，判断该样本基因型。上述方案中，所述步骤3）中，所述特异性的单碱基延伸引物为T1、T2、T3和T4，在引物T1、T2、T3和T4上分别用不同数量的polyT修饰，优选的所述T1引物上polyT修饰的数量为0个；所述T2引物上polyT修饰的数量为3或5个，更有选的是3个；所述T3引物上polyT修饰的数量为10；所述T4引物上polyT修饰的数量为15。当T1引物上polyT修饰的数量为0个，T2引物上polyT修饰的数量为3个，T3引物上polyT修饰的数量为10个，T4引物上polyT本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于SNaPshot技术的小鼠肝炎病毒分型检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：1）PCR扩增以样本MHV病毒RNA的cDNA为模板进行PCR扩增，得到含有目的基因的PCR产物；所述PCR扩增采用的是序列为SEQ ID No：1所示的 P1和SEQ ID No：2所示的 P2 PCR引物，和/或序列为SEQ ID No：3所示的 P3和SEQ ID No：4 所示的P4PCR引物；2）PCR产物纯化对步骤1）中得到的PCR产物进行纯化，得到纯化PCR产物；3）单碱基延伸使用单碱基延伸酶、ddNTPs、延伸反应缓冲液和特异性的单碱基延伸引物对步骤2）中得到的纯化PCR产物进行单碱基延伸；延伸完毕后，向反应体系中加入虾碱性磷酸酶SAP处理，得处理液Ⅰ，取处理液Ⅰ，加入Liz120 size standard内标和Hi‑Di 甲酰胺处理，得处理液Ⅱ，取处理液Ⅱ进行测序仪电泳分析所述样本的基因型，进而得出样本分型结果；所述特异性的单碱基延伸引物为T1、T2、T3和T4中的一条或多条，所述T1、T2、T3和T4的序列如SEQ IDNo：5、SEQ ID No：6、SEQ ID No：7和SEQ ID No：8所示，所述ddNTPs进行荧光标记，所述T1、T2、T3和T4序列中的一个或多个序列的5’端用poly T修饰。...

【技术特征摘要】
1.基于SNaPshot技术的小鼠肝炎病毒MHV1、MHV3、JHM和/或A59的毒株检测方法，所述的方法为非疾病诊断和治疗方法，其特征在于，具体包括以下步骤：1)PCR扩增以样本MHV病毒RNA的cDNA为模板进行PCR扩增，得到含有目的基因的PCR产物；所述PCR扩增采用的是序列为SEQIDNo：1所示的P1和SEQIDNo：2所示的P2PCR引物，和/或序列为SEQIDNo：3所示的P3和SEQIDNo：4所示的P4PCR引物；2)PCR产物纯化对步骤1)中得到的PCR产物进行纯化，得到纯化PCR产物；3)单碱基延伸使用单碱基延伸酶、ddNTPs、延伸反应缓冲液和特异性的单碱基延伸引物对步骤2)中得到的纯化PCR产物进行单碱基延伸；延伸完毕后，向反应体系中加入虾碱性磷酸酶SAP处理，得处理液Ⅰ，取处理液Ⅰ，加入120sizestandard内标和Hi-Di甲酰胺处理，得处理液Ⅱ，取处理液Ⅱ进行测序仪电泳分析所述样本的基因型，进而得出样本分型结果；所述特异性的单碱基延伸引物为T1、T2、T3和T4，所述T1、T2、T3和T4的序列如SEQIDNo：5、SEQIDNo：6、SEQIDNo：7和SEQIDNo：8所示，所述ddNTPs进行荧光标记，所述T1、T2、T3和T4序列中的一个或多个序列的5’端用polyT修饰。2.根据权利要求1所述的基于SNaPshot技术的小鼠肝炎病毒毒株检测方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述特异性的单碱基延伸引物为T1、T2、T3和T4，所述T1引物上polyT修饰的数量为0个，所述T2引物上polyT修饰的数量为3或5个，所述T3引物上polyT修饰的数量为10，所述T4引物上polyT修饰的数量为15。3.根据权利要求2所述的基于SNaPshot技术的小鼠肝炎病毒毒株检测方法，其特征在于：所述T1、T2、T3和T4引物摩尔比例为2:3:2.5:5。4.根据权利要求1所述的基于SNaPshot技术的小鼠肝炎病毒毒株检测方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述PCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：赖国旗，谭毅，潘永全，何明忠，赵婷婷，严磊，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：重庆;85