马铃薯中黑胫病菌的实时荧光LAMP检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种马铃薯中黑胫病菌的实时荧光LAMP检测方法及试剂盒，采用6条特异性引物对马铃薯中黑胫病菌进行实时荧光LAMP检测方法，不仅可实现肉眼观察和荧光呈色结果的判定，同时可通过实时荧光LAMP分析仪实现对马铃薯黑胫病菌检测过程的全程实时监控。

【技术实现步骤摘要】
马铃薯中黑胫病菌的实时荧光LAMP检测方法及试剂盒
本专利技术涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种马铃薯中黑胫病菌的实时荧光 LAMP检测方法及试剂盒。
技术介绍
马铃薯黑胫病（Potato Black Leg)现在仍然是冷凉地区马铃薯生产上一种主要 的细菌性病害，病原是果胶杆菌属的黑胚病菌Pectobacterium atrosepticum (Pca)(以前 是Erwinia carotovora subsp.atroseptica)。Pca是可以导致马铃薯块、莖腐烂的革兰氏 阴性的植物病原细菌，它的寄主范围仅限于马铃薯。该病是通过种薯带菌传播，马铃薯种 薯中黑胫病菌存在肉眼无法诊察的潜伏侵染，这种潜伏侵染逐代累积逐渐表现症状造成危 害，因此检测黑胫病菌的方法是否灵敏、特异及快速至关重要。 各国把马铃薯黑胫病菌列为重要植物检疫对象，田间症状识别一直是马铃薯黑 胫病监测的重要手段，然而这种方法常受到环境条件、寄主本身和其它病害所引起的症状 的干扰，使检测的准确性受到限制。传统的马铃薯黑胫病菌分离方法耗时较长，至少需半 个月，而且灵敏度较低；国际推荐方法为双层抗体夹心的方法（DASI)，它的检测范围是每 mL富极培养基中含IO2?IO6Eca细胞；PCR方法敏感、准确、快速，可替代传统检测方法， 但由于需要昂贵的仪器设备、繁琐的电泳过程以及对检测人员较高的技术要求，而使其难 以普及和推广。因此，研究对种薯中黑胫病菌的快速灵敏检测的方法具有非常重要的意 义。吸取了前人传统生理学检测方法、免疫学和分子生物学为基础的快速检测马铃薯黑 胫病菌的经验，研究开发了马铃薯黑胫病菌的实时荧光改良环介导等温扩增（Real-time fluorescence improved LAMP)试剂盒。 最早将LAMP技术开发成商品化检测试剂盒的是日本荣研化学株式会社，它的产 品主要用于环境和食品安全方面的检测，包括沙门氏菌，大肠杆菌检测、单核细胞增多性李 斯特氏菌检测等。国内首先开发出LAMP检测试剂盒的是广州华峰生物科技有限公司，其产 品包括6种食源微生物检测试剂盒和18种病原微生物检测试剂盒原型。但到目前为止， 还未见到实时荧光改良LAMP检测马铃薯种薯中黑胫病菌的试剂盒的报道。LAMP结果判定 可通过肉眼观察有无白色焦磷酸镁沉淀，但容易因视觉差异，可能造成误判；添加荧光染料 SYBR Green I进行呈色，容易造成扩增产物的污染，而造成误判；进行琼脂糖凝胶电泳，观 察梯形条带，费时费力。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种方便快捷且高特异性 高灵敏度的马铃薯中黑胫病菌的检测方法及试剂盒。 为了实现本专利技术目的，本专利技术首先提供一种马铃薯中黑胫病菌的实时荧光LAMP 检测方法，所述方法具体包括以下步骤： 1)提取待检样品基因组DNA作为LAMP检测反应的t旲板； 2)配制反应液，构建检测体系； 所述的反应液包括： 步骤1)提取的DNA模板； 两条外引物：F3 :5' -AACGATGGTTTCCAGGAAA-3'， B3 :5, -ACTTCGGATCCGGCACTT-3,； 两条内引物：FIP: 5' -TCAGCGTACGGGTCATCGCCAACAATATTCCGCAGCGTGATG-3'， BIP: 5，-ATCCAAAATCAGCGCGACCGGTCACAGACACCACAGCAATC-3，； 两条环引物：LF: 5 ' -CGGCCAAGTGTGTACCA-3 '， LB: 5，-GATGCGCGCGAAGGGCT-3，； 3)等温扩增反应：将所述反应液离心混匀，进行等温扩增反应； 4)结果判断：根据通过实时荧光分析仪，实时观察荧光曲线扩增情况。 若通过肉眼观察有无白色焦磷酸镁沉淀，或添加荧光染料SYBR Green I进行呈 色，或通过琼脂糖凝胶电泳，观察梯形条带进行判定时，在步骤3)等温扩增反应之后对酶 进行灭活处理即可。酶灭活处理条件为，80°C，IOmin灭活。 进一步地，所述检测体系为25 μ L突光改良LAMP反应体系，包括：两条内引物各 1. 28 μ M，两条外引物各0. 32 μ M，两条环引物0. 64 μ M，2 μ LDNA模板。 更进一步地，所述检测体系为25 μ L荧光改良LAMP反应体系，还包括0.6mM dNTP， 0.4M甜菜碱，ImM MgSO4,10 XBst DNA聚合酶反应缓冲液，8U的Bst DNA聚合酶大片段， 0.5 μ L SYBR Green I〇 在本专利技术【具体实施方式】中，所述检测体系为25yL荧光改良LAMP反应体系：由 两条内引物$1?和81?)各1.28以1，两条外引物$3和83)各0.32以11，两条环引物（1^ 和 LB)0.64yM，0.6mM dNTP，0.4M 甜菜碱（Sigma，St.Louis，Mo.)，lmM MgS04，10XBst DNA 聚合酶反应缓冲液（New England Biolabs，MA)(20mM Tris-HCl (ρΗ8· 8)，IOmM KC1， 10mM(NH4)2S04,2mM MgS04,0.1%Triton X-100)，8U的Bst DNA聚合酶大片段（New England Biolabs，Beverly，MA)，0· 5 μ LSYBR GreenI (I :200 稀释），2 μ LDNA 模板和用灭菌双蒸水补 足体系。 作为优选，所述等温扩增反应于61°C反应40min。 进一步地，所述步骤1)包括： 步骤⑴制备待检样品溶液； 步骤（2)通过热裂解法提取待检样品基因组DNA。 其中，所述步骤（1)制备待检样品溶液具体为：将待测马铃薯切块，经70%酒精作 用l-3min，用灭菌去离子水冲洗3次后，加 ImL灭菌去离子水，在无菌研磨管中研磨成匀浆， 瞬时离心后，静置IOmin,取上清液于离心管,作为待检样品溶液。 其中，所述步骤（2)通过热裂解法提取待检样品基因组DNA具体为： A、取待检样品溶液lmL，11000rpm/min离心Imin,弃上清； B、加入100 μ L灭菌去离子水悬浮沉淀，11000rpm/min离心Imin,弃上清；重复操 作一次； C、加入100 μ L灭菌去离子水悬浮沉淀，100°C，10_15min，冷却至室温，IlOOOrpm 离心lmin，取上清，-20°C冷冻保存，备用。 进一步地，所述步骤4)的判断方法为：实时观察荧光曲线扩增情况，有S荧光曲 线，即扩增，样品判定为阳性；无 S荧光曲线，即无扩增，样品判定为阴性。 作为优选，所述实时荧光LAMP检测方法还包括以灭菌的双蒸水为阴性对照。 本专利技术还提供了一种马铃薯中黑胫病菌的实时荧光LAMP检测试剂盒，所述试剂 盒包括： 两条外引物：F3 :5 ' -AACGATGGTTTCCAGGAAA-3 '， B3 :5, -ACTTCGGATCCGGCACTT-3,； 两条内引物：FIP: 5' -TCAGC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种马铃薯中黑胫病菌的实时荧光LAMP检测方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：1)提取待检样品基因组DNA作为LAMP检测反应的模板；2)配制反应液，构建检测体系；所述的反应液包括：步骤1)提取的DNA模板；两条外引物：F3：5’‑AACGATGGTTTCCAGGAAA‑3’，B3：5’‑ACTTCGGATCCGGCACTT‑3’；两条内引物：FIP:5’‑TCAGCGTACGGGTCATCGCCAACAATATTCCGCAGCGTGATG‑3’，BIP:5’‑ATCCAAAATCAGCGCGACCGGTCACAGACACCACAGCAATC‑3’；两条环引物：LF:5’‑CGGCCAAGTGTGTACCA‑3’，LB:5’‑GATGCGCGCGAAGGGCT‑3’；3)等温扩增反应：将所述反应液离心混匀，进行等温扩增反应；4)结果判断：根据通过实时荧光分析仪，实时观察荧光曲线扩增情况。

【技术特征摘要】
1. 一种马铃薯中黑胫病菌的实时荧光LAMP检测方法，其特征在于，所述方法具体包括 以下步骤： 1) 提取待检样品基因组DNA作为LAMP检测反应的模板； 2) 配制反应液，构建检测体系； 所述的反应液包括： 步骤1)提取的DNA模板； 两条外引物：F3 :5' -AACGATGGITTCCAGGAAA-3'， B3 :5, -ACTTCGGATCCGGCACTT-3,； 两条内引物：FIP: 5' -TCAGCGTACGGGTCATCGCCAACAATATTCCGCAGCGTGATG-3'， BIP:5' -ATCCAAAATCAGCGCGACCGGTCACAGACACCACAGCAATC-3' ； 两条环引物：LF: 5 ' -CGGCCAAGTGTGTACCA-3 '， LB:5, -GATGCGCGCGAAGGGCT-3,； 3) 等温扩增反应：将所述反应液离心混匀，进行等温扩增反应； 4) 结果判断：根据通过实时荧光分析仪，实时观察荧光曲线扩增情况。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测体系为25 μ L荧光改良LAMP 反应体系，包括：两条内引物各1. 28 μ Μ,两条外引物各0. 32 μ Μ,两条环引物0. 64 μ Μ, 2 μ LDNA 模板。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述检测体系为25 μ L荧光改良LAMP反 应体系，还包括0. 6mM dNTP，0. 4M甜菜碱，lmMMgS04，10XBst DNA聚合酶反应缓冲液，8U的 Bst DNA聚合酶大片段，0.5yL SYBR Green I。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述等温扩增反应于61°C反应40min。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)包括： 步骤（1)制备待检样品溶液； 步骤（2)通过热裂解法提取待检样...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱杰华，杨志辉，胡连霞，赵冬梅，杨毅清，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：河北;13