本发明专利技术公开了四种胰高血糖素样肽-1，公开了能够识别上述四种多肽的单克隆，公开了能识别上述四种多肽的多克隆抗体，本发明专利技术还公开了一种检测血清、或者血浆GLP-1总含量的ELISA试剂盒，包括有生物活性的GLP-1(7-37)、GLP-1(7-36)NH2肽、无生物活性的GLP-1(9-37)和GLP-1(9-36)NH2肽、四种肽链BSA融合蛋白、能够识别上述四种GLP-1的单克隆抗体、多克隆抗体和酶标记多克隆抗体。本发明专利技术是一种快速、稳定、可靠的诊断、治疗及疗效检测GLP-1缺乏相关性疾病的有效工具。
【技术实现步骤摘要】
人胰高血糖素样肽-1、抗体及其试剂盒
： 本专利技术属于生物工程领域，尤其涉及一种多肽及其单克隆、多克隆抗体和试剂盒。
技术介绍
： 2010年的统计资料显示中国现有成人糖尿病患者达9240万（发病率10% )，更 令人担忧的是还有巨大数量的成人糖耐量受损者（Impaired glucose tolerance, IGT)。如 何更有效地预防糖尿病，特别是2型糖尿病（type2diabetets mellitus，T2DM)发生、有效 地控制病情发展、减少并发症的发生，已经成为全民族共同关注的焦点之一。 胰岛α细胞分泌胰高血糖素、β细胞分泌胰岛素，两者作用互为相反，在维持机 体血糖浓度中起至关重要作用。在胰岛α细胞中，胰高血糖素原基因的主要表达产物是胰 高血糖素，而在肠粘膜的L细胞中，胰高血糖素原基因表达的产物经前激素转换酶剪切， 其中羧基端的段肽链即为胰高血糖素样肽-1 (glucagon-like peptide-1，GLP-1)。GLP-1 有2种生物活性形式，分别为61^-1(7-37)和61^-1(7-36)順2,61^-1约80%的循环活性 来自GLP-l(7-36)。生物活性GLP-1在体内被二肽酶（DPP-IV)、中性肽链内切酶（NEP)降 解成无活性的GLP-1 (9-37)和GLP-1 (9-36)NH2,半衰期极短仅2min。 研究已证实，GLP-1以葡萄糖浓度依赖性方式促进胰岛β细胞分泌胰岛素，并减 少胰岛胰高血糖素分泌从而降低血糖。正常人在进餐后，GLP-1开始分泌，进而促进胰岛 素分泌，以减少餐后血糖的波动。但对于T2DM患者，其肠促胰素效应受损，主要表现 为进餐后GLP-1浓度升高幅度较正常人有所减小，但其促进胰岛素分泌以及降血糖的作用 并无明显受损。动物实验和临床研究已经证明GLP-1可通过多种机制明显地改善T2DM动 物模型或患者的血糖情况，其中促进胰岛β细胞的再生和修复，增加胰岛β细胞数量的 作用尤为显著，这为T2DM的治疗提供了一个非常好的前景。同时GLP-1的这种葡萄糖浓 度依赖性降糖特性是其临床应用安全性的基础与保障，从而免除了人们对现有糖尿病治 疗药物及方案可能造成患者严重低血糖的担心。此外，动物和临床研究显示，一些治疗措 施，如胃转流术治疗非肥胖型糖尿病、胃部分切除术治疗肥胖症以及中医药治疗糖尿病等， 均能通过调节循环GLP-1水平来达达到治疗目的，同时通过监测治疗前后外周血中GLP-1 水平来指导、调整治疗方案。 近年来，多个制药企业，如美国的礼来公司、默克公司、百时美施贵宝公司，瑞士罗 氏制药等均在研制GLP-1相关药物，有的在进行临床试验，有的已经完成了临床试验进入 市场，表明GLP-1在不久的将来必定成为IGT、T2DM的常用治疗药物之一。 在GLP-1作为新的治疗方法应用于临床之前，必须完成一个重要的基础工作，那 就是要建立快速、准确的测定方法判断患者体内是否真正存在GLP-1分泌不足！准确地监 测GLP-1含量变化，对于T2DM的分型诊断、个性化治疗以及不同个体用药剂量等均是必不 可少的前提，此外检测方法的建立也是进一步研究GLP-1在IGT、T2DM、代谢综合征等GLP-1 缺乏相关性疾病的发病机制及早期预防研究的实验基础。目前在国内定量检测患者血液中 总GLP-1含量的ELISA试剂盒尚未见报道。
技术实现思路
： 本专利技术的目的在于提供一种人胰高血糖素样肽-1、抗体及其试剂盒，所述的这种 人胰高血糖素样肽-1、抗体及其试剂盒要解决现有技术中没有合适的检测患者血液中总 GLP-1含量的ELISA试剂盒的技术问题。 一种人源性GLP-1肽链，氨基酸序列如下： GLP-1(7-37):HAEGTFTSDVSSTLEGQAAKEFIAWLVKGRG 一种人源性GLP-1肽链，氨基酸序列如下： GLP-1(7-36):HAEGTFTSDVSSTLEGQAAKEFIAWLVKGR 一种人源性GLP-1肽链，氨基酸序列如下： GLP-1(9-37):EGTFTSDVSSTLEGQAAKEFIAWLVKGRG 一种人源性GLP-1肽链，氨基酸序列如下： GLP-1(9-36):EGTFTSDVSSTLEGQAAKEFIAWLVKGR 本专利技术还提供了一种单克隆抗体，其特征在于：能够识别权利要求1、2、3、或者4 所述的多肽。 本专利技术还提供了一种多克隆抗体，其特征在于：能够识别权利要求1、2、3、或者4 所述的多肽，并由HRP标记。 进一步的，所述的单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO :C2014108的杂交瘤细胞株 所分泌的。 本专利技术还提供了一种杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCC NO :C2014108。 本专利技术提供了一种试剂盒，含有权利要求1?4所述的多肽、或者权利要求5所述 的单克隆抗体、或者权利要求6所述的多克隆抗体。 进一步的，所述的试剂盒用于检测血清、或者血浆中的生物活性和失活的GLP-1 总含量。 本专利技术还提供了一种采用ELISA的方法测定血液或者血浆中GLP-1总含量的方 法，包括如下步骤： 1) -个制备反应板的步骤，在所述的制备反应板的步骤中，采用保藏号为CCTCC NO :C2014108的单克隆抗体作为包被抗体，用包被缓冲液作1:1000稀释，加于微孔板中，每 孔l〇〇ul，置2?5°C冰箱中，20?50小时后取出，用蒸馏水冲洗2?6次，拍干，于微孔板 中加入0. 5% BSA-PBS，每孔100ul，置30?40°C水浴中1?3小时，取出，用蒸馏水冲洗 2?6次，拍干； 2) -个配置标准液的步骤，先配置缓冲液，所述的缓冲液为0. 5 % BSA-0. 05% TWeen20-PBS，然后取合成肽抗原GLP-1 (9-36)NH2,用缓冲液配，配制成74. 5uM的溶液冷冻 保存； 3)取上述GLP-l(9-36)融合蛋白（74. 5umol/L)用封闭液封闭，每孔100ul，置 30?40°C水浴中1?3小时，取出，用蒸馏水冲洗2?6次，拍干； 4)力卩入 HRP-标记兔抗 GLP-1 抗体，用 ρΗ7· 2,0· 5 % BSA-0. 05 % Tween20-0. 15molPBS作1:1500稀释，加于微孔板中，每孔100ul，置2?5°C冰箱中，20? 50小时后取出，用蒸馏水冲洗2?6次，拍干； 5)加邻苯二胺底物显色，室温15分钟，用2mol硫酸终止显色； 6)使用主波长492nm，付波长640nm比色； 7)每个96孔酶标板均设0?2980nmol/L标准曲线和空白孔，以吸光度为横坐标， 以浓度为纵坐标绘出标准曲线，以各待测样本的吸光度值在标准曲线上查出该样本GLP-1 的浓度。 本专利技术提供的单克隆、多克隆抗体，可用于建立其它的免疫检测方法测定人源性 GLP-1总含量，如胶体金快速检测、免疫比浊法等。 本专利技术的一种杂交瘤细胞株，其分类命名为：杂交瘤细胞株2D11-2,该细胞株保 藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)中，中国典型培养物保藏中心的地址为：湖北省武本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人源性GLP‑1肽链，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
1. 一种人源性GLP-1肽链，其氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。2. -种人源性GLP-1肽链，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。3. -种人源性GLP-1肽链，其氨基酸序列如SEQ ID NO :3所示。4. 一种人源性GLP-1肽链，其氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示。5. -种单克隆抗体，其特征在于：能够识别权利要求1、2、3、或者4所述的多肽。6. -种多克隆抗体，其特征在于：能够识别权利要求1、2、3、或者4所述的多肽，并由 HRP标记。7. 如权利要求5所述的单克隆抗体，其特征在于：是由保藏号为CCTCC NO : C2014108的杂交瘤细胞株所分泌的。8. -种杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCC NO :C2014108。9. 一种试剂盒，其特征在于：含有权利要求Γ4所述的多肽、或者权利要求5所述的单 克隆抗体、或者权利要求6所述的多克隆抗体。10. 如权利要求9所述的一种试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒用于检测血清、或者 血浆中的生物活性和失活的GLP-1总含量。11. 一种采用ELISA的方法测定血液或者血浆中GLP-1总含量的方法，其特征在于包括 如下步骤： 1) 一个制备反应板的步骤，在所述的制备反应板的步骤中，采用保藏号为CCTCC NO : C2014108的单克隆抗体作为包被抗体，用包被缓冲液作1:1000稀...
【专利技术属性】
技术研发人员：范列英，刘颖冰，
申请(专利权)人：上海市东方医院，
类型：发明
国别省市：上海;31
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