一种气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法技术

本发明专利技术公开了一种气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，旨在提供一种快捷、简便，图像结果优质凝胶电泳分型方法；其技术方案：将采集分离到的气单胞菌在TSA平板上、37℃条件下培养14-18小时，用无菌接种环刮取单菌落于CSB缓冲液中，制成5-6Mcf的细菌悬浊液；配制凝胶溶液；取细菌悬浊液于离心管中，加入的蛋白酶K，SDS，混匀后再加入凝胶溶液，得到混合溶液；将得到的混合溶液注入成胶模具，在室温下凝固30分钟，得到胶块；制备消化液，将步骤得到的胶块放入步骤的消化液中，消化裂解；洗胶块；胶块内DNA酶切；加样；电泳；获取图像分析。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种脉冲场凝胶电泳分型方法，尤其是一种气单胞菌脉冲场凝胶电泳 分型方法。
技术介绍
气单胞菌是属于气单胞菌科的革兰氏阴性杆菌，广泛分布于自然界，可从水源、土 壤以及人的粪便中分离。其可引起蛙的红腿病，鳖的红脖子病，鲑鳟鱼类的疖疮病以及在水 产养殖史上造成重大经济损失的淡水鱼类细菌性败血症，并且气单胞菌还可引起牛猝死及 人的肺部严重感染，是一种典型的人-兽-鱼共患致病菌。对于共患致病菌需要通过分型 的方法对致病菌的来源进行追踪和分析。 对细菌分型的方法主要包括基于表型特征的表型分型方法和基于基因特征的基 因分型方法。由于细菌易受环境影响，表型性状表达呈不确定性，基于基因水平的分子分型 方法，较之更为稳定和可信。目前常用的基因分型方法包括：随机扩增DNA多态性（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)、限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、肠道细菌重复基因间共有序列 PCR(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus Sequence PCR，ERIC_PCR)、脉冲场凝胶电泳（PFGE)、 质粒分型等.基于PCR技术的RAPD，RFLP，ERIC-PCR虽然具有快速简便的优点，但检测的均 为染色体中的某些片段，并且重复性较差。质粒分型针对的对象为质粒，而质粒相对于染色 体更容易获得或缺失，稳定性差。脉冲场凝胶电泳是基于整个细菌基因组的分型技术，具有 稳定性好，分辨率高的特点，被誉为分子分型的金标准。然而它也具有实验流程长，操作 繁琐。。
技术实现思路
针对上述不足，本专利技术的前一个目的在于提供一种快捷、简便，图像结果优质的单 胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法。 为此，本专利技术提供的技术方案是这样的：该气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，依 次包括下述步骤： 1)胶块的制备 I. 1)将采集分离到的气单胞菌在TSA平板上培养14-18小时，用无菌接种环刮取 单菌落于CSB缓冲液中，制成5-6Mcf的细菌悬浊液； 1. 2)配制凝胶溶液； 1. 3)取步骤I. 1)所述的细菌悬浊液于离心管中，加入的蛋白酶K，SDS，混匀后再 加入步骤1. 2)中的凝胶溶液，吹打均匀，得到混合溶液； 1. 4)将步骤1. 3)得到的混合溶液注入成胶模具，在室温下凝固30分钟，得到胶 块； 2)胶块消化裂解 2· 1)制备消化液， 2. 2)将步骤I. 4)得到的胶块放入步骤2. 1)的消化液中，盖上滤筛盖，消化裂解； 3)洗胶块 4)胶块内DNA酶切： 4. 1)将20 μ L的XbaI限制性内切酶IOX缓冲液加入180 μ L的超纯水中配成酶 切缓冲液； 4. 2)将洗涤后胶块切成大小为2mmX 4mm，放入装有步骤1)酶切缓冲液的离心管 中并置于冰上30分钟； 4. 3)吸出步骤4. 2)中的酶切缓冲液，在离心管中加入已混匀的含有75UXbaI、 20μ L BSA、20y L XbaI限制性内切酶IOX缓冲液和155μ L超纯水的酶切液，在37°C水浴 锅中孵化3小时； 5)加样 6)电泳 在电泳槽中加入TBE缓冲液，待电泳缓冲液恒定为12_15°C后，将步骤5)制好的胶 块放于电泳槽中进行电泳。 7)获取图像分析。 上述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，步骤1. 2)配制凝胶溶液的方法是用 TE缓冲液配制低熔点琼脂糖溶液，使其浓度为2 %，并将凝胶溶液放置于54°C水浴中平衡 备用。 上述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，步骤1. 3)的具体方法为：取95 μ L上 述细菌悬浊液于I. 5mL离心管中，加入5μ L20mg/ml的蛋白酶Κ，5μ 120% SDS，混匀后再加 入步骤1. 2)中的凝胶溶液95 μ L，吹打均匀。 上述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，步骤2. 1)所述的制备消化酶的方法 是在装有5ml TES缓冲液的50ml离心管中加入25 μ L20mg/ml的蛋白酶Κ，混合均勻，得到 消化液，置于冰上备用。 上述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，步骤2. 2)所述的消化方法为在54°C、 175r/min的水浴摇床中消化3小时。； 上述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，步骤3)所述的洗胶块依次包括下述 步骤： 3. 1)将超纯水及TE缓冲液放置于水浴锅中预热至50°C备用； 3. 2)将步骤2. 2)中消化完成的胶块离心管取出，倒出管中消化液，倒入10_15ml 已预热到50°C的超纯水，使胶块在液面以下，放回50°C水浴摇床中摇洗10-15分钟，结束后 再见管内超纯水倒出，再倒入10-15ml50°C的超纯水，50°C水浴摇床中摇洗10-15分钟； 3. 3)将步骤3. 2)水浴完成后离心管中的超纯水倒出，加入10-15mL已预热到 50°C的TE缓冲液，50°C水浴摇床中摇洗10-15分钟；再重复此TE洗涤步骤3次；完成后，从 水浴锅中取出离心管，冷却至室温。 上述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，步骤5)所述的加样依次包括下述步 骤： 5. 1)将上述酶切完成的离心管从水浴锅中取出，吸取酶切液，加入Iml TBE缓冲 液，确保胶块处于液面下，置于冰上30min ; 5. 2)用TBE缓冲液配制1 %的脉冲场琼脂糖溶液，置于50-60°C恒温箱中平衡15 分钟； 5. 3)将步骤5. 1)中的小胶块取出置于电泳梳子齿底部，确保梳子上所有胶块处 于一条直线，并用吸水纸吸取胶块周围液体； 5.4)把加完样的电泳梳子放入胶槽，使电泳梳子齿与胶槽底部距离为l_2mm，并 使整个制胶装置处于水平位置；将平衡完成的脉冲场琼脂糖溶液注入胶槽，避免气泡产生， 室温下凝固30分钟； 上述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，步骤6)所述的所述的电泳所设电泳 电压为6V/cm，起始脉冲时间10s，终止脉冲时间35s，电场夹角120°，电泳时间22小时； 上述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，步骤7)所述的图像获取的方法依次 包括下述步骤： 7. 1)电泳完成后，将胶块从电泳槽中取出，放入装有0. 5 μ g/ml EB溶液的避光盒 子中，使溶液没过胶块而，并将盒子放置摇床中振荡30分钟， 7. 2)步骤完成后，将盒子中的EB溶液换成同体积的纯水，于摇床上振荡脱色60分 钟，期间换纯水一次； 7. 3)脱色完成后取出胶块，吸去胶块上多余水份，在凝胶成像系统下成像拍摄。 上述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，所述的CSB缓冲液的组份为：100mM TrisUOOmM EDTA，pH 为 8.0。 与现有技术相比，本专利技术提供的技术方案从减少有毒试剂的使用，减少细菌悬浊 离心、溶菌酶作用的步骤，缩短蛋白酶K消化和限制性内切酶消化的时间以及修改电泳参 数四方面使现有气单胞菌PFGE方法得以优化。 表1已报道的气单胞菌PFGE方法与本专利技术的技术方法对比 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，依次包括下述步骤： 1)胶块的制备 1.1)将采集分离到的气单胞菌在TSA平板上培养14‑18小时，用无菌接种环刮取单菌落于CSB缓冲液中，制成5‑6Mcf的细菌悬浊液； 1.2)配制凝胶溶液； 1.3)取步骤1.1)所述的细菌悬浊液于离心管中，加入的蛋白酶K，SDS，混匀后再加入步骤1.2)中的凝胶溶液，吹打均匀，得到混合溶液； 1.4)将步骤1.3)得到的混合溶液注入成胶模具，在室温下凝固30分钟，得到胶块； 2)胶块消化裂解 2.1)制备消化液， 2.2)将步骤1.4)得到的胶块放入步骤2.1)的消化液中，盖上滤筛盖，消化裂解； 3)洗胶块 4)胶块内DNA酶切： 4.1)将20μL的XbaI限制性内切酶10×缓冲液加入180μL的超纯水中配成酶切缓冲液； 4.2)将洗涤后胶块切成大小为2mm×4mm，放入装有步骤1)酶切缓冲液的离心管中并置于冰上30分钟； 4.3)吸出步骤4.2)中的酶切缓冲液，在离心管中加入已混匀的含有75U XbaI、20μL BSA、20μL XbaI限制性内切酶10×缓冲液和155μL超纯水的酶切液，在37℃水浴锅中孵化3小时； 5)加样 6)电泳 在电泳槽中加入TBE缓冲液，待电泳缓冲液恒定为12‑15℃后，将步骤5)制好的胶块放于电泳槽中进行电泳。 7)获取图像分析。...

【技术特征摘要】
1. 一种气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，依次包括下述步骤： 1) 胶块的制备 1. 1)将采集分离到的气单胞菌在TSA平板上培养14-18小时，用无菌接种环刮取单菌 落于CSB缓冲液中，制成5-6Mcf的细菌悬浊液； 1. 2)配制凝胶溶液； 1. 3)取步骤1. 1)所述的细菌悬浊液于离心管中，加入的蛋白酶K，SDS，混匀后再加入 步骤1. 2)中的凝胶溶液，吹打均匀，得到混合溶液； 1. 4)将步骤1. 3)得到的混合溶液注入成胶模具，在室温下凝固30分钟，得到胶块； 2) 胶块消化裂解 2. 1)制备消化液， 2.2)将步骤1.4)得到的胶块放入步骤2.1)的消化液中，盖上滤筛盖，消化裂解； 3) 洗胶块 4) 胶块内DNA酶切： 4. 1)将20 μ L的Xbal限制性内切酶10 X缓冲液加入180 μ L的超纯水中配成酶切缓 冲液； 4. 2)将洗涤后胶块切成大小为2mmX4mm，放入装有步骤1)酶切缓冲液的离心管中并 置于冰上30分钟； 4. 3)吸出步骤4. 2)中的酶切缓冲液，在离心管中加入已混匀的含有75U XbaI、20yL BSA、20 μ L Xbal限制性内切酶10X缓冲液和155 μ L超纯水的酶切液，在37°C水浴锅中孵 化3小时； 5) 加样 6) 电泳 在电泳槽中加入TBE缓冲液，待电泳缓冲液恒定为12-15°C后，将步骤5)制好的胶块放 于电泳槽中进行电泳。 7) 获取图像分析。2. 根据权利要求1所述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，步骤1. 2) 配制凝胶溶液的方法是用TE缓冲液配制低熔点琼脂糖溶液，使其浓度为2%，并将凝胶溶 液放置于54°C水浴中平衡备用。3. 根据权利要求1所述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，步骤1. 3) 的具体方法为：取95 μ L上述细菌悬浊液于1. 5mL离心管中，加入5 μ L20mg/ml的蛋白酶K， 5 μ 120% SDS，混匀后再加入步骤1. 2)中的凝胶溶液95 μ L，吹打均匀。4. 根据权利要求1所述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，步骤2. 1) 所述的制备消化酶的方法是在装有5ml TES缓冲液的50ml离心管中加入25 μ L20mg/ml的 蛋白酶K，混合均匀，得到消化液，置于冰上备用。5. 根据权利要求1所述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，步骤2. 2) 所述的消化方法为在54°C、175r/min的水浴摇床中消化3小...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓玉婷，黄玉萍，姜兰，谭爱萍，王伟利，罗理，梁爱玲，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44