本发明专利技术涉及一种利用黄孢原毛平革菌选择性产生木质素降解酶的方法。本发明专利技术提供了利用黄孢原毛平革菌产生木质素降解酶的方法，包括如下步骤：在含有处于非浸没状态的固定化培养载体的培养基中发酵黄孢原毛平革菌，收集发酵产物，即得到木质素降解酶；本发明专利技术的实验证明，采用本方法进行木质素降解酶发酵，不需在培养过程中通入纯氧或含高浓度氧气的空气，只需控制培养基中的碳氮源浓度和加入非浸没量的载体，即可在空气条件下选择性获得木质素降解酶。本发明专利技术方法条件控制简单，获得的木质素降解酶选择性强。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，尤其涉及。
技术介绍
白腐真菌是一种高等丝状真菌，在分类上大多数属于担子菌纲，生长在树木或木材上，因引起木质白色腐烂而得名。白腐真菌降解木质素，是因为它能够产生木质素降解酶，并分泌到细胞外。木质素降解酶对木质素的降解是以自由基为基础的链反应过程，具有极强的底物非特异性和氧化性，这种降解机制使木质素降解酶不仅能够降解木质素，还能够降解环境中的许多异生物质和持久性有毒有机污染物(Barr&Aust，1994 ；Cameron etal.，2000 ；Gao et al.，2010)。因此，白腐真菌及其木质素降解酶在环境污染控制及其生物修复等方面具有重要的应用价值。 黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)是白腐真菌产生木质素降解酶和降解环境污染物研究的模式菌种(Wesenberg et al., 2003 ；Singh&Chen, 2008),属非裙菌目(Phyllophorales)、伏革科(Corticiaceae)和显革菌属(Phanerochaete)。P.chrysosporium木质素降解酶系统主要包括木质素过氧化物酶(LiP, ECl.11.1.14)、猛过氧化物酶(MnP, ECl.11.1.13)和产H2O2的氧化酶。木质素过氧化物酶和猛过氧化物酶是糖基化的含铁的多种同功酶，木质素过氧化物酶能够催化对非酚类木质素型式化合物和芳香族污染物的氧化，锰过氧化物酶能够催化对木质素、木质素衍生物和很多酚类的木质素型式化合物的氧化。黄孢原毛平革菌木质素降解酶的合成受到多种营养和环境因素的复杂调节，木质素降解酶能够在受到氮、碳或硫营养限制时激发产生，在高氧条件下表现活跃(Faison&Kirk, 1985 ；Dosoretz et al., 1990)。高氧条件被认为可以改善氧在菌丝中的传质，特别是在胞外多糖积累的情况下，从而诱导酶的合成。一般认为黄孢原毛平革菌不产生漆酶。 木质素降解酶的应用依赖于酶的高水平发酵。黄孢原毛平革菌木质素降解酶发酵的研究，主要包括以下方面(Ikehata et al., 2004 ；Singh&Chen, 2008):(1)发酵的营养条件(包括合适的碳源、氮源、微量元素、溶解氧和诱导物等)；(2)发酵的环境条件(如温度、pH、搅拌和固定化条件等)；和(3)反应器发酵放大的研究。木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶是紧密相关的酶类，在白腐真菌中通常同时产生。不过，二者的催化机制有所不同，对不同结构的底物具有不同的降解能力(Cameron et al., 2000 ；Martinez, 2002) 0由于两种过氧化物酶的产生受到营养和环境因素影响的程度存在差异，两种酶的合成在共同的调节性质之外可能存在各自的特征。因此，利用营养和环境条件对酶合成调节的差异，有可能实现两种过氧化物酶的选择性产生。过氧化物酶的选择性产生有助于木质素降解酶合成和调节机制的研究，同时对于满足具有不同结构特征有机污染物的降解需要具有重要的应用意义。至今，利用黄孢原毛平革菌选择性产生木质素降解酶的报道还很罕见。Bonnarme和Jeffries (1990a, b)发现锰离子(Mn2+)对黄孢原毛平革菌木质素降解酶合成具有不同的调节效应，通过控制培养基中Mn2+浓度在气升式反应器中实现了黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶的选择性产生，不过，要求纯氧通入是其发酵过程的一个限制。李华钟等(2002)同样研究了黄孢原毛平革菌在Mn2+浓度调节下木质素降解酶的选择性产生，不过效果尚不够理想，且仍受纯氧供应的限制。 除了 Mn2+控制，目前，还没有见到利用其他调节手段实现黄孢原毛平革菌木质素降解酶选择性产生的报道，尤其是在空气环境中。木质素降解酶在空气条件下的有效合成对于酶的大规模发酵具有成本效益和更大的可行性。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种利用黄孢原毛平革菌产生木质素降解酶的方法。 本专利技术提供的方法，包括如下步骤:在含有处于非浸没状态的固定化培养载体的培养基中发酵黄孢原毛平革菌，收集发酵产物，即得到木质素降解酶； 所述含有处于非浸没状态的固定化培养载体的培养基为将所述固定化培养载体加入用于培养白腐真菌的液体培养基中，且使其堆积高度高于所述液体培养基液面，处于非浸没状态，得到的培养基。 上述方法中，所述含有处于非浸没状态的固定化培养载体的培养基中固定化培养载体的含量大于等于1.8g/100mL。 上述方法中，所述含有处于非浸没状态的固定化培养载体的培养基中固定化培养载体的含量为 1.8g/100mL-3.0g/100mL,具体为 1.8g/100mL、2.2g/100mL、2.6g/100mL 或3.0g/100mL。 上述方法中，所述液体培养基为碳限制液体培养基，用其发酵产生的木质素降解酶为木质素过氧化物酶； 所述碳限制液体培养基具体为C原子和N原子的摩尔比小于等于3.8的碳限制液体培养基。 上述方法中，所述碳限制液体培养基中的C原子来源于葡萄糖，N原子来源于酒石酸铵； 每IL所述碳限制培养基由终浓度为5.04g/L葡萄糖、终浓度为4.05g/L酒石酸铵、终浓度为2.0g/L KH2PO4、终浓度为0.5g/L MgSO4、终浓度为0.lg/L CaCl2、终浓度为lmg/L维生素B1、终浓度为1.5mM藜芦醇、pH 4.4且终浓度为20mM乙酸缓冲液和70mL/L微量元素溶液组成； 所述微量元素溶液由终浓度为3g/L MgS04、终浓度为0.5g/L MnS04、终浓度为1.0g/L NaCl、终浓度为 0.lg/L FeSO4.7H20、终浓度为 0.lg/L CoCl2、终浓度为 0.lg/LZnSO4.7H20、终浓度为 0.lg/L CuS04、终浓度为 10mg/L AlK(SO4)2.12H20、终浓度为 10mg/LH3BO3、终浓度为10mg/L Na2MoO4.2H20、终浓度为1.5g/L次氮基三乙酸盐和水组成。 上述方法中，所述液体培养基为氮限制液体培养基，用其发酵产生的木质素降解酶为锰过氧化物酶； 所述氮限制液体培养基具体为C原子和N原子的摩尔比大于等于152.7的氮限制液体培养基。 上述方法中，所述氮限制液体培养基中的C原子来源于葡萄糖，N原子来源于酒石酸铵； 每IL所述氮限制液体培养基为用终浓度为10.08g/L葡萄糖、终浓度为0.203g/L酒石酸铵替换掉所述碳限制液体培养基中的葡萄糖和酒石酸铵，其余组分与所述碳限制液体培养基相同。 上述方法中，所述液体培养基的pH值均为4.4 ； 所述固定化培养载体为惰性材料，具体为聚氨酯泡沫块；所述聚氨酯泡沫块的边长尤其具体为0.5cm。 本专利技术的另一个目的是提供一种利用黄孢原毛平革菌产生木质素降解酶的试剂盒。 本专利技术提供的试剂盒，包括上述含有处于非浸没状态的固定化培养载体的培养基。 上述方法中，所述木质素降解酶为木质素过氧化物酶或锰过氧化物酶。 上述方法或试剂盒中，所述黄孢原毛平革菌为BKM-F-1767，所述培养基的pH均为4.0-5.0，所述本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用黄孢原毛平革菌产生木质素降解酶的方法，包括如下步骤：在含有处于非浸没状态的固定化培养载体的培养基中发酵黄孢原毛平革菌，收集发酵产物，即得到木质素降解酶；所述含有处于非浸没状态的固定化培养载体的培养基为将所述固定化培养载体加入用于培养白腐真菌的液体培养基中，且使其堆积高度高于所述液体培养基液面，处于非浸没状态，得到的培养基。
【技术特征摘要】
1.一种利用黄孢原毛平革菌产生木质素降解酶的方法，包括如下步骤:在含有处于非浸没状态的固定化培养载体的培养基中发酵黄孢原毛平革菌，收集发酵产物，即得到木质素降解酶； 所述含有处于非浸没状态的固定化培养载体的培养基为将所述固定化培养载体加入用于培养白腐真菌的液体培养基中，且使其堆积高度高于所述液体培养基液面，处于非浸没状态，得到的培养基。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述含有处于非浸没状态的固定化培养载体的培养基中固定化培养载体的含量大于等于1.8g/100mL。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于: 所述含有处于非浸没状态的固定化培养载体的培养基中固定化培养载体的含量为1.8g/100mL>2.2g/100mL>2.6g/100mL 或 3.0g/100mL。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于: 所述液体培养基为碳限制液体培养基，用其发酵产生的木质素降解酶为木质素过氧化物酶； 所述碳限制液体培养基具体为C原子和N原子的摩尔比小于等于3.8的碳限制液体培养基。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于: 所述碳限制液体培养基中的C原子来源于葡萄糖，N原子来源于酒石酸铵； 每IL所述碳限制培养基由终浓度为5.04g/L葡萄糖、终浓度为4.05g/L酒石酸铵、终浓度为2.0g/L KH2PO4、终浓度为0.5g/L MgSO4、终浓度为0.lg/L CaCl2、终浓度为lmg/L维生素B1、终浓度为1.5mM藜芦醇、pH 4.4且终浓度为20mM乙酸缓冲液和70mL/L微量元素溶液组成； 所述微量...
【专利技术属性】
技术研发人员：文湘华，喻国策，钱易，王建龙，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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