一种人工改造的葡萄糖氧化酶基因及其表达应用，属于蛋白或酶制剂改造工程以及葡萄糖氧化酶生产领域。所要解决的问题是在现有葡萄糖氧化酶的基础上进一步提高其酶的活性。本发明专利技术通过蛋白或酶制剂改造工程中的非理性手段DNA shuffling技术改造来自于黑曲霉Z-25的葡萄糖氧化酶基因，挑选DNaseI随机切割后的基因片段利用DNA shuffling技术将片段重组成为完整变异基因，与穿梭表达质粒连接之后整合入酵母的基因组中。从突变库中筛选得到酶活显著提高的菌株，其变异序列如SEQ ID NO.2所示。在酵母的3L放大试验当中葡萄糖氧化酶的最终酶活达到了较高的水平。最后在酶活与基因层面，验证得到的高酶活表达菌株有着良好的遗传性。
【技术实现步骤摘要】
一种人工改造的葡萄糖氧化酶基因及其表达应用
本专利技术涉及非理性蛋白改造手段，尤其涉及利用DNAshuffling技术对黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶基因进行改造，本专利技术还涉及变异之后的葡萄糖氧化酶基因在分泌生产葡萄糖氧化酶中的应用，属于蛋白或酶制剂改造工程以及葡萄糖氧化酶生产领域。
技术介绍
葡萄糖氧化酶(GlucoseOxidase，E.C.1.1.3.4，简称GOD)能够在有氧气的条件下专一性催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，广泛地分布于动物、植物和微生物体内(PluschkellS,HellmuthK,RinasU.KineticsofglucoseoxidaseexcretionbyrecombinantAspergillusniger.BiotechnolBioeng1996；51:215-20.)。但由于微生物具有生长繁殖速度快，来源广等特点，所以微生物成为葡萄糖氧化酶的主要来源，微生物中的主要生产菌株为黑曲霉和青霉。葡萄糖氧化酶在食品、医药及生物等领域有着广泛的应用。在食品工业中，用于去除食品中的葡萄糖，防止褐变；还可用于食品脱氧，改善食品和饮料的品质；同时还用于面粉的改良工艺等方面(RasiahIA,SuttonKH,LowFL,LinHM,GerrardJA.Crosslinkingofwheatdoughproteinsbyglucoseoxidaseandtheresultingeffectsonbreadandcroissants.FoodChem2005；89:325–32.；CruegerA,CruegerW.Glucosetransformingenzymes.In:FogartyWM,KellyCT,editors.Microbialenzymesandbiotechnology.NewYork:Elsevier；1990.p.177–226.)。在医药工业中，用于血糖的测定及尿糖、尿酮体的检测，可制成糖尿试纸或试剂盒用于临床诊断；还可防治口腔疾病和牙病(WilsonR,TurnerAPF.Glucoseoxidase:andidealenzyme.BiosensBioelectron1992；7:165-85；EtemadzadehH,AinamoJ,MurtomaaH.Plaquegrowth-inhibitingeffectsofanabrasivefluoride–chlorhexidinetoothpasteandafluoridetoothpastecontainingoxidativeenzymes.JClinPeriodontol1985；7:607-16.)。在制酒工业中，葡萄糖氧化酶可以通过去除葡萄糖降低酒精的浓度，从而降低酒的酒精度而生产低度酒(MalherbeDF,duToitM,CorderoRR,vanRensburgP,PretoriusIS.ExpressionoftheAspergillusnigerglucoseoxidasegeneinSaccharomycescerevisiaeanditspotentialapplicationsinwineproduction.ApplMicrobiolBiotechnol2003；5-6:502-11[Mypaper].；PickeringGJ,HeatherbellDA,BarnesMF.Optimisingglucoseconversionintheproductionofreducedalcoholwineusingglucoseoxidase.FoodResInt1998；31(10):685-92.)。葡萄糖氧化酶也被用在工业生产葡萄糖酸上，通过还原葡萄糖酸内酯而产生葡萄糖酸。葡萄糖酸可以作为调节食品酸值是添加剂，也可制成补充人体所需各种微量元素的葡萄糖酸盐而生产销售(NakaoK,KiefnerA,FurumotoK,HaradaT.Productionofgluconicacidwithimmobilizedglucoseoxidaseinairliftreactors.ChemEngSci1997；52:4127–33.；KleinJ,RosenbergM,MarkosJ,DolgosO,KroslakM,KristofikovaL.BiotransformationofglucosetogluconicacidbyAspergillusniger—studyofmasstransferinanairliftbioreactor.BiochemEngJ2002；3568:1–9.)。葡萄糖氧化酶也被应用在纺织行业中，因为葡萄糖氧化酶在作用过程中会产生过氧化氢，可以起到漂白作用。这种方式产生的过氧化氢已经经过验证，表现出标准漂白过程同样的效果。更加值得一提的是，在这个漂白过程中不需要额外添加稳定剂，因为过程中产生的葡萄糖酸可以充当稳定剂的角色(TzanovT,SilgiaA,GubitzGM,Cavaco-PaulμloA.Hydrogenperoxidegenerationwithimmobilizedglucoseoxidasefortextilebleaching.JBiotechnol2002；93:87–94.)。目前最常见的葡萄糖氧化酶来源是通过黑曲霉、青霉以及酵母菌属的发酵得来。多数商业化的葡萄糖氧化酶是从黑曲霉的菌丝体中分离得到的。有中国的研究者通过有机溶剂沉淀、聚乙二醇二次沉淀、羟基磷灰石柱色谱分离，得到比活性超过190U/ml蛋白的产品(ChineseJournalofPharmaceutical1997,28(7))。但是由于黑曲霉的发酵主要是用作生产葡萄糖酸或者葡萄糖酸盐的，比如葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钙，因此葡萄糖氧化酶主要是作为一种副产物出现，而这导致葡萄糖氧化酶的生产酶活并不高，很多都是只有个位数的酶活(S.B.Bankaretal./BiotechnologyAdvances27(2009)489-501)。随着分子生物学技术的发展，研究者试图通过微生物表达系统来表达外源基因，以此来达到对某一种蛋白高效表达的目的。目前已经开发出的外源基因表达系统包括大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌、曲霉、酵母、昆虫、哺乳类细胞等等。通常情况下，使用原核细胞作为外源基因的表达体系操作简便，各种技术已经趋于成熟，但是受原核系统本身的限制，真核来源的蛋白在表达的时候不能正确地折叠或者缺少转录翻译之后的必要修饰，从而导致表达出了蛋白，可是蛋白却没有生物活性，没有进一步的利用价值，而且原核系统中的有毒蛋白质或者有抗原作用的蛋白很可能会混杂在终产物中，使结果受到干扰。但是，原核表达仍然具有重要意义，可以作为真核系统表达之前验证一种蛋白可以脱离自身来源系统而通过另一种系统而表达的手段。而对于真核哺乳动物细胞作为宿主，可以较为理想地进行蛋白表达后的修饰，但是由于操作困难，而且后期培养细胞会有病毒感染的可能，因此这种方法并没有成为广泛使用的方法。所以目前主流的蛋白表达体系是酵母体系。酵母系统通过几十年的发展目前已经成为一种模式操作平台，各项操作已经趋于完善。在蛋白表达方面本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种通过非理性突变得到的新的人工改造的葡萄糖氧化酶基因，其特征在于：核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种通过非理性突变得到的新的人工改造的葡萄糖氧化酶基因，其特征在于：核酸序列如SEQIDNO.2所示。2.一种通过非理性突变得到的新的人工改造的葡萄糖氧化酶，其特征在于：氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。3.各种含有权利要求2中涉及到的氨基酸序列为SEQIDNO.3所示的氨基酸序列的葡萄糖氧化酶表达菌株。4.权利要求1中所述基因在分泌表达葡萄糖氧化酶中的应用。5.根据权利要求4中所述基因在分泌表达葡萄糖氧化酶中的应用，其特征在于：将所述的通过非理性突变得到的新的人工改造的葡萄糖氧化酶基因在原核细胞中，与用于原核细胞进行基因操作所用的穿梭表达质粒连接构成重组表达质粒；将重组表达质粒转化入真核细胞表达蛋白并整合...
【专利技术属性】
技术研发人员：谭天伟，张琛，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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