白化病模型猪的重构卵及其构建方法和模型猪的构建方法技术

本发明专利技术涉及一种白化病模型猪的重构卵及其构建方法和模型猪的构建方法，该重构卵的构建方法通过敲除酪氨酸酶基因获得了白化小型猪的重构卵，且将CRISPR/Cas9基因敲除技术与体细胞核移植技术结合，证明该方法用于构建基因修饰猪的高效可行性。获得TYR基因敲除猪具有典型白化特征，可为人类白化疾病研究提供一种可靠的动物模型，且能应用于毒性及过敏反应的检测等多方面，有望成为类似白化小鼠的一种标准化实验动物。

【技术实现步骤摘要】
白化病模型猪的重构卵及其构建方法和模型猪的构建方法
本专利技术涉及基因工程领域，尤其是涉及一种白化病模型猪的重构卵及其构建方法和模型猪的构建方法。
技术介绍
人类疾病的研究和治疗离不开实验动物模型。啮齿类动物在基因表达和各项生理指标方面与人类差异较大，而非人灵长类动物虽是最接近于人类的实验动物，但价格昂贵，且存在伦理方面的障碍。猪在体型大小、生理条件、器官发育和疾病发展等方面与人类相似，因此，猪被认为是一种合适的实验动物模型。基因修饰猪模型有望在人类疾病发病机理研究、治疗策略研究中发挥重要的作用。目前制作基因修饰动物的方法中只有胚胎细胞嵌合法和转基因克隆法能够实现哺乳动物的基因打靶。通过基因修饰胚胎干细胞和嵌合体技术相对容易获得基因修饰小鼠，但迄今还没有办法获得具有生殖系嵌合能力的猪胚胎细胞，因而基因修饰猪制备要比小鼠困难很多。研究人员一直致力于开发新方法，实现高效率的基因定点修饰。最近兴起的锌指技术(ZincFingerNucleases，ZFNs)和TALENs(TRNAscriptionactivator-like(TAL)effectornucleases)技术为基因打靶技术创造了新的途径。有研究显示利用ZFNs技术可使猪体细胞中基因打靶效率从10-6提高到4％以上(YangD，YangH，LiW，etal.ProductionofPPAR-gammamono-allelicknockoutpigsviazinc-fingernucleasesandnucleartRNAsfercloning.CellResearch，2011，21(6):979-82.)。利用TALENs技术也成功高效率地获得了大鼠、斑马鱼、爪蟾、小鼠、兔等多种基因打靶动物。ZFNs和TALENs技术极大地提高了基因打靶效率，但ZFNs和TALENs技术设计和构建组装仍需要有前后序列特异的要求，经大量的优化条件以获得特定的基因打靶，在的获得性、灵活性、费用上均受到限制(Juillerat，A.，Dubois，G.，Valton，J.，etal.ComprehensiveanalysisofthespecificityoftRNAscriptionactivator-likeeffectornucleases.NucleicAcidsRes.，2014，42，5390–5402.)。CRISPR/Cas9(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat(CRISPR)/CRISPR-associatedendonuclease(Cas9))技术主要基于细菌的一种获得性免疫系统改造而成。该系统由两部分组成：一是哺乳动物密码子优化版本的Cas9蛋白，其带有一个核定位信号，以确保在哺乳动物细胞的核中表达；二是引导核糖核酸(Single-guideRNA，gRNAs)指引Cas9的蛋白质进行序列特异性地切割目标DNA。较ZFNs或TALENS而言，CRISPR/Cas9系统具有可扩展性和复用性、能同时作用于多个靶位点(WangH，YangH，ShivalilaCS，etal.One-stepgenerationofmicecarryingmutationsinmultiplegenesbyCRISPR/Cas-mediatedgenomeengineering.Cell，2013，153:910–918)等优点，被认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具(MussolinoC，CathomenT.RNAguidesgenomeengineering.NatBiotechnol，2013，31(3):208-209)。利用CRISPR/Cas9已获得多种基因打靶动物，如大鼠、小鼠、兔子、猴子等，但均是通过注射Cas9mRNA和gRNAmRNA到一细胞胚胎的方法获得的，这种方法获得的克隆动物多是带有多种突变类型的嵌合体，需进行多次交配和选择才能得到单一突变基因型的动物。白化病是人和动物界的一种常见疾病。目前白化小鼠己成为生物医药研究中常用的实验动物，在烧伤、皮肤毒性、过敏检测等研究中使用较多，但是迄今为止仍未有基因修饰型白化猪的报道。目前野生型小型猪的皮肤和毛发多为黑色或花色，在研究中不利于观察，而野生型白色猪中多见于商品肉用大型猪种，体型大不利于实验操作，不适合做实验动物。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种白化病模型猪的重构卵及其构建方法和模型猪的构建方法。一种白化病模型猪的重构卵的构建方法，包括如下步骤：步骤一：针对猪物种的酪氨酸酶基因的第一外显子的正链及互补链上满足G(N)19NGG序列模式的序列部分分别设计gRNA的识别序列，分别记为第一gRNA识别序列和第二gRNA识别序列，其中，所述第一gRNA识别序列与所述第一外显子的正链上序列G(N)19一致，所述第二gRNA识别序列与所述第一外显子的互补链上序列G(N)19一致，N为A、T、C或G，下标19表示N的个数；步骤二：分别对所述第一gRNA识别序列和第二gRNA识别序列设计互补序列，以构建含有所述第一gRNA识别序列的第一双链DNA和含有第二gRNA识别序列的第二双链DNA；步骤三：分别根据所述第一双链DNA和所述第二双链DNA设计gRNA表达载体，记为第一gRNA载体和第二gRNA载体，其中，所述第一gRNA载体中含有所述第一双链DNA，所述第二gRNA载体中含有所述第二双链DNA；步骤四：将所述第一gRNA载体、所述第二gRNA载体及含有Cas9切口酶基因的表达载体转染进微型猪胎儿成纤维细胞中，筛选出酪氨酸酶基因敲除的阳性克隆细胞；步骤五：将所述阳性克隆细胞注入母猪的去核卵母细胞中，形成重构卵。在其中一个实施例中，所述步骤一中，所述猪物种的酪氨酸酶基因的序列为NCBI数据库中基因编号为407745所示的序列；所述第一外显子的正链上满足G(N)19NGG序列模式的序列如SEQIDNo.1所示，所述第一外显子的互补链上满足G(N)19NGG序列模式的序列如SEQIDNo.2所示；所述第一gRNA识别序列如SEQIDNo.3所示，所述第二gRNA识别序列如SEQIDNo.4所示。在其中一个实施例中，所述步骤二具体包括如下步骤：分别对所述第一gRNA识别序列和第二gRNA识别序列设计互补序列；在所述第一gRNA识别序列的5’端加上CACC序列片段，形成如SEQIDNo.7所示的序列片段，并在所述第一gRNA识别序列的互补序列的5’端加上AAAC序列片段，形成如SEQIDNo.8所示的序列片段，将加有粘性末端的第一gRNA识别序列及加有粘性末端的互补序列进行退火处理，得到带有粘性末端的所述第一双链DNA；在所述第二gRNA识别序列的5’端加上CACC序列片段，形成如SEQIDNo.9所示的序列片段，并在所述第二gRNA识别序列的互补序列的5’端加上AAAC序列片段，形成如SEQIDNo.10所示的序列片段，将加有粘性末端的第二gRNA识别序列及加有粘性末端的互补序列进行退火处理，得到带有粘性末端的所述第二双链DNA。在其中一个实施例中，所述步骤三具体包括如下步骤：在gRNA-GFP-T1质粒载体中引入两个B本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种白化病模型猪的重构卵的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：针对猪物种的酪氨酸酶基因的第一外显子的正链及互补链上满足G(N)19NGG序列模式的序列部分分别设计gRNA的识别序列，分别记为第一gRNA识别序列和第二gRNA识别序列，其中，所述第一gRNA识别序列与所述第一外显子的正链上序列G(N)19一致，所述第二gRNA识别序列与所述第一外显子的互补链上序列G(N)19一致，N为A、T、C或G，下标19表示N的个数；步骤二：分别对所述第一gRNA识别序列和第二gRNA识别序列设计互补序列，以构建含有所述第一gRNA识别序列的第一双链DNA和含有第二gRNA识别序列的第二双链DNA；步骤三：分别根据所述第一双链DNA和所述第二双链DNA设计gRNA表达载体，记为第一gRNA载体和第二gRNA载体，其中，所述第一gRNA载体中含有所述第一双链DNA，所述第二gRNA载体中含有所述第二双链DNA；步骤四：将所述第一gRNA载体、所述第二gRNA载体及含有Cas9切口酶基因的表达载体转染进微型猪胎儿成纤维细胞中，筛选出酪氨酸酶基因敲除的阳性克隆细胞；步骤五：将所述阳性克隆细胞注入母猪的去核卵母细胞中，形成重构卵。...

【技术特征摘要】
1.一种白化病模型猪的重构卵的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：针对猪物种的酪氨酸酶基因的第一外显子的正链及互补链上满足G(N)19NGG序列模式的序列部分分别设计gRNA的识别序列，分别记为第一gRNA识别序列和第二gRNA识别序列，其中，所述第一gRNA识别序列与所述第一外显子的正链上序列G(N)19一致，所述第二gRNA识别序列与所述第一外显子的互补链上序列G(N)19一致，N为A、T、C或G，下标19表示N的个数；所述猪物种的酪氨酸酶基因的序列为NCBI数据库中基因编号为407745所示的序列；所述第一外显子的正链上满足G(N)19NGG序列模式的序列如SEQIDNo.1所示，所述第一外显子的互补链上满足G(N)19NGG序列模式的序列如SEQIDNo.2所示；步骤二：分别对所述第一gRNA识别序列和第二gRNA识别序列设计互补序列，以构建含有所述第一gRNA识别序列的第一双链DNA和含有第二gRNA识别序列的第二双链DNA；步骤三：分别根据所述第一双链DNA和所述第二双链DNA设计gRNA表达载体，记为第一gRNA载体和第二gRNA载体，其中，所述第一gRNA载体中含有所述第一双链DNA，所述第二gRNA载体中含有所述第二双链DNA；步骤四：将所述第一gRNA载体、所述第二gRNA载体及含有Cas9切口酶基因的表达载体转染进微型猪胎儿成纤维细胞中，筛选出酪氨酸酶基因敲除的阳性克隆细胞；步骤五：将所述阳性克隆细胞注入母猪的去核卵母细胞中，形成重构卵。2.如权利要求1所述的白化病模型猪的重构卵的构建方法，其特征在于，所述步骤一中，所述第一gRNA识别序列如SEQIDNo.3所示，所述第二gRNA识别序列如SEQIDNo.4所示。3.如权利要求2所述的白化病模型猪的重构卵的构建方法，其特征在于，所述步骤二具体包括如下步骤：分别对所述第一gRNA识别序列和第二gRNA识别序列设计互补序列；在所述第一gRNA识别序列的5’端加上CACC序列片段，形成如SEQIDNo.7所示的序列片段，并在所述第一gRNA识别序列的互补序列的5’端加上AAAC序列片段，形成如SEQIDNo.8所示的序列片段，将加有粘性末端的第一gRNA识别序列及加有粘性末端的互补序列进行退火处理，得到带有粘性末端的所述第一双链DNA；在所述第二gRNA识别序列的5’端加上CACC序列片段，形成如SEQIDNo.9所示的序列片段，并在所述第二gRNA识别序列的互补序列的5’端加上AAAC序列片段，形成如SEQIDNo.10所示的序列片段，将加有粘性末端的第二gRNA识别序列及加有粘性末端的互补序...

【专利技术属性】
技术研发人员：赖良学，信吉阁，杨化强，邹庆剑，樊娜娜，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44