猪SOD1基因在抗PRRS病毒中的应用制造技术

本发明专利技术涉及猪SOD1基因在抗PRRS病毒中的新用途，具体提供了猪SOD1基因在抗PRRS病毒中的应用，其是通过猪SOD1基因的CDS序列在细胞中的过表达来抑制PRRS病毒在细胞中的复制。本发明专利技术还提供了制备抗PRRS病毒转基因猪的方法，以及利用SOD1基因表达量筛选抗PRRS病毒猪的方法。

【技术实现步骤摘要】
猪SOD1基因在抗PRRS病毒中的应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体地说，涉及猪SOD1基因在抗PRRS病毒中的应用。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)，俗称“蓝耳病”是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的，该病毒是巢状病毒目动脉炎病毒科的一个成员，同属的病毒还有马动脉炎病毒、鼠乳酸脱氢酶病毒和猴出血热病毒。该病主要引起猪的繁殖与呼吸症状，表现为间质性肺炎和母猪流产木乃伊胎等，每年对全世界的养猪业造成了巨大的经济损失。2007年在中国爆发了一场高热病，该病迅速在全国范围蔓延，超过200万头猪被感染，40万头猪死亡，该病最后证实是由一种高致病性的蓝耳病毒引起的。PRRSV主要感染猪的肺泡巨噬细胞，现在研究表明在感染PRRSV后，先天免疫中PRRSV感染不能引起有效的I型干扰素应答，体液免疫不能及时产生有效的中和抗体，而且会形成抗体依赖的病毒增强效应，最终导致免疫抑制和持续感染。由于该病毒的突变率极高，传统疫苗方法也不能有效控制该病，很多研究都致力于寻找RNAi、干扰素等新的方法来针对该病毒，用于弥补传统方法的不足。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供猪SOD1基因在抗PRRS病毒中的新用途。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供猪SOD1基因在抗PRRS病毒中的应用，其是通过猪SOD1基因的CDS序列在细胞中的过表达来抑制PRRS病毒在细胞中的复制。本专利技术中涉及的猪SOD1基因的CDS序列如下：i)SeqIDNo.1所示的核苷酸序列；或ii)SeqIDNo.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或iii)在严格条件下与SeqIDNo.1所示序列杂交的核苷酸序列；所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。本专利技术还提供猪SOD1基因的表达载体，优选地，所述表达载体的出发载体为pCMV-Myc-N，在出发载体pCMV-Myc-N中导入猪SOD1基因的CDS序列。本专利技术还提供含有上述表达载体的工程菌。本专利技术还提供含有上述表达载体的转基因细胞系。所述转基因细胞来自除胚胎细胞外的猪体细胞。本专利技术还提供一种制备克隆胚胎的方法，其是以上述转基因细胞为核移植供体细胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得克隆胚胎。本专利技术还提供一种制备抗PRRS病毒转基因猪的方法，其是将猪SOD1基因的CDS序列整合至猪基因组中，从而实现在猪中过表达SOD1基因。本专利技术进一步提供一种筛选抗PRRS病毒猪的方法，即根据猪SOD1基因表达量筛选抗PRRS病毒猪。SOD1表达量高的猪比SOD1表达量低的猪具有更高的抗PRRS病毒感染能力。本专利技术首次发现SOD1(superoxidedismutase1)基因与抗蓝耳病相关，它可以编码生成铜/锌超氧化物歧化酶，其分布在生物体内的各个组织器官中；超氧化歧化酶主要负责清除生物体正常代谢产生的有害氧自由基O2-(超氧阴离子自由基)，而O2-具有细胞毒性，可使脂质过氧化，损伤细胞膜，引起炎症，肿瘤和自身免疫性疾病，并可能促使机体衰老。研究发现，过表达SOD1可以显著抑制PRRS病毒在猴胚胎肾上皮细胞Marc145中的复制。本专利技术发现的新的抑制PRRSV复制的猪SOD1基因主要包括以下两个用途：(一)可以通过对猪的SOD1基因的表达量的测定，筛选抗PRRS病毒猪。分析表明，相对于没有过表达SOD1基因的细胞，过表达SOD1基因的细胞可以显著抑制PRRS病毒的复制，因此，SOD1表达量高的猪可能会比SOD1表达量低的猪更加抗PRRSV的感染，从而达到根据SOD1基因的表达量高低来筛选抗PRRSV的猪。(二)可以利用转基因等基因工程技术手段，使得SOD1基因在猪中的表达量升高，从而得到SOD1表达量高的猪，进而培育出抗PRRSV的猪。附图说明图1为本专利技术实施例1中转录组数据分析得到的SOD1在通城猪和长白猪感染PRRSV的第0天、第3天、第5天和第7天肺组织中的表达模式和相对表达量；横坐标代表时间点，纵坐标代表相对表达量(RPKM)。图2为本专利技术实施例2中原始载体pCMV-Myc-N的载体图谱。图3为本专利技术实施例2中MARC145细胞攻毒实验后24小时PRRSV的拷贝数；横坐标代表对照组和攻毒组；纵坐标代表PRRSVORF7的相对表达量。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,Molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1利用分析转录组数据方法发现新的抗PRRSV感染的基因SOD1由于不同的猪品种和个体的遗传背景差异，对蓝耳病的抗性也不同，研究表明在临床症状和生理生化指标上，通城猪、梅山猪等国内猪品种相较于国外长白猪、大白猪等感染高致病性PRRSV后有较强的抗性。通过高通量测序的方法，对感染PRRSV前后长白猪和通城猪的组织做差异基因表达分析，某些免疫相关的基因表达量在感染前后两个品种间有显著的差异。通过对不同品种间PRRSV感染造成的基因表达差异的分析，不仅可以研究蓝耳病的感染机制，还可以找出抗性或易感相关的基因，从而为蓝耳病的治疗和预防提供新方法。前期实验通过对6个品种猪(长白猪、大白猪、杜洛克猪、清平猪、梅山猪、通城猪)感染高致病性蓝耳病毒(PRRSV)进行抗病猪的筛选，通过临床症状记录：采食量、体温、生理生化、细胞因子以及存活时间等的检测，最后得到了对蓝耳病抗性差异较大的两个品种，长白猪(易感猪)、通城猪(抗病猪)。选取抗病猪和易感猪各8头，分别在第0天和感染高致病PRRSV后第3、5、7天宰杀取样，肺组织提取总RNA，建库进行高通量测序，通过生物信息学分析。分析结果表明，在攻毒后第3天，SOD1在通城猪肺组织中的相对表达量(RPKM)72.17，大于长白猪的41.77；而且在通城猪肺组织中SOD1的表达在感染后3、5、7天持续升高，在长白猪肺组织中SOD1在感染后第3和第5天却大幅度下调(图1)。实施例2利用细胞生物学研究方法验证SOD1基因抗PRRSV感染1.设计针对SOD1基因(GenBank登录号为NM_001190422)的引物，利用反转录PCR技术，反转录mRNA并扩增得到SOD1基因的CDS序列，引物序列如下：上游引物SOD1-F：5′-GCGTCGACCATGGCGACGAAGGCCGTGT-3′下游引物SOD1-R：5′-CCCTCGAGTTACTGGGTGATCCCAATTAC-3′将扩增得到的SOD1基因的CDS序列(SEQIDNo.1)导入原始载体pCMV-Myc-N(购自Clonetech公司，载体图谱如图2所示)，构建pCMV-SOD1-Myc载体。由于pCMV-Myc-N具有CMV强启动子，能够使导入其中的SOD1基因进行过表达。pCMV-SOD1-Myc载体的构建方法如下：提取猪肺组织的总RNA，并进行反转形成cDNA，利用引物扩增得到SOD1基因的CDS序列；将CDS序列进本文档来自技高网...

【技术保护点】
猪SOD1基因在抗PRRS病毒中的应用，其特征在于，其是通过猪SOD1基因的CDS序列在细胞中的过表达来抑制PRRS病毒在细胞中的复制，所述猪SOD1基因的CDS序列为：i)Seq ID No.1所示的核苷酸序列；或ii)Seq ID No.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或iii)在严格条件下与Seq ID No.1所示序列杂交的核苷酸序列；所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。

【技术特征摘要】
1.猪SOD1基因在制备抗PRRS病毒的药物中的应用，其特征在于，其是通过猪SOD1基因的CDS序列在细胞中的过表达来抑制PRRS病毒在细胞中的复制，所述猪SOD1基因的CDS序列如SeqIDNo.1所示。2.一种筛选抗PRRS病毒猪的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李宁，李佳，任立明，胡晓湘，杨倩，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11