本发明专利技术涉及动物病毒学和免疫学领域，提供了一种宿主防御蛋白的表达及其在抗禽白血病病毒的应用，具体提供了一种禽防御蛋白chZAP，该蛋白含有4个稳定的CCCH结构域，通过结合Zn2+可以自我折叠形成稳定的短的“手指”结构；具mRNA结合特性，在RNA病毒感染时，会通过与病毒mRNA3’端或5’端结合使之失去感染性，从而辅助免疫细胞防御外源病毒。本发明专利技术利用慢病毒载体将chZAP基因转入DF-1细胞的基因组，通过chZAP的过量表达，有效的抑制了逆转录病毒ALV-J的增殖，证实了chZAP的抗禽白血病病毒作用，同时为J亚群禽白血病的防治提供科学基础和技术支撑，降低养禽业因ALV-J感染造成的经济损失。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及动物病毒学和免疫学领域，提供了一种宿主防御蛋白的表达及其在抗禽白血病病毒的应用，具体提供了一种禽防御蛋白chZAP，该蛋白含有4个稳定的CCCH结构域，通过结合Zn2+可以自我折叠形成稳定的短的“手指”结构；具mRNA结合特性，在RNA病毒感染时，会通过与病毒mRNA3’端或5’端结合使之失去感染性，从而辅助免疫细胞防御外源病毒。本专利技术利用慢病毒载体将chZAP基因转入DF-1细胞的基因组，通过chZAP的过量表达，有效的抑制了逆转录病毒ALV-J的增殖，证实了chZAP的抗禽白血病病毒作用，同时为J亚群禽白血病的防治提供科学基础和技术支撑，降低养禽业因ALV-J感染造成的经济损失。【专利说明】-种禽CCCH型锌指蛋白chZAP及其应用
本专利技术涉及动物病毒学和免疫学领域，具体提供了一禽CCCH型锌指蛋白ChZAP及 其应用。
技术介绍
CCCH型锌指抗病毒蛋白（ZAP)是近年新发现的、可特异性降解病毒mRNA的真核细 胞抗病毒防御系统中的超蛋白家族成员。ZAP具mRNA结合特性，在RNA病毒感染时，会通过 与病毒mRNA3'端或5'端结合使之失去感染性，从而辅助免疫细胞防御外源病毒。由于其 自身的结构特点，可以选择性的结合特异的靶结构，使锌指蛋白在基因的表达调控、细胞分 化、胚胎发育等生命过程中发挥重要作用。 CCCH型锌指抗病毒蛋白具体而言是含有4个稳定的CCCH结构域，通过结合Zn2+ 可以自我折叠形成稳定的短的"手指"结构的一类宿主蛋白质。自1985年在爪蟾卵母细胞 中发现第一个锌指蛋白以来，如今已在动物、植物、微生物中陆续发现包括CCCH(C :半胱氨 酸，H :组氣酸）在内的九类与基因调控有关的锋指蛋白。2002年，Gao等在小鼠细胞内发 现了一种CCCH型锌指蛋白，可以直接结合Moloney鼠白血病病毒（MMLV) RNA序列引起mRNA 降解，从而抑制病毒在细胞内的复制，因此将此蛋白命名为CCCH型锌指抗病毒蛋白（ZAP)， 该蛋白承担了一种细胞内限制因子的作用，限制各类敏感病毒感染。此外，ZAP编码基因是 许多干扰素刺激基因（ISGs)之一。这些因子在无干扰素的基础条件下，具有限制病毒复制 的能力，因此，在先天免疫途径中起着重要作用。 而禽白血病病毒为RNA病毒，如何结合ZAP的生物学特性，利用ZAP对抗ALV感染 有望成为禽白血病高效防控的新途径。
技术实现思路
针对现有技术中的相关情况，本专利技术的专利技术人提供了一种宿主防御蛋白的表达及 其在抗禽白血病病毒的应用，具体提供了一种禽防御蛋白chZAP，该蛋白含有4个稳定的 CCCH结构域，通过结合Zn2+可以自我折叠形成稳定的短的"手指"结构；具mRNA结合特 性，在RNA病毒感染时，会通过与病毒mRNA3'端或5'端结合使之失去感染性，从而辅助免 疫细胞防御外源病毒。本专利技术利用慢病毒载体将chZAP基因转入DF-I细胞的基因组，通过 chZAP的过量表达，有效的抑制了逆转录病毒ALV-J的增殖，证实了 chZAP的抗禽白血病病 毒作用，同时为J亚群禽白血病的防治提供科学基础和技术支撑，降低养禽业因ALV-J感染 造成的经济损失。 专利技术人首先从禽类体内获得了一种禽CCCH型锌指蛋白ChZAP，编码该蛋白的核苷 酸序列如SEQ ID NO. 1所示； 该禽CCCH型锌指蛋白chZAP N末端功能区的保守序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。 专利技术人发现该锌指蛋白具有与现有发现的其他物种锌指蛋白相同的功能，可以特 异性降解病毒mRNA ; 针对上述发现，专利技术人结合实际情况，提供了一种chZAP慢病毒重组载体，并利用 该载体成功的过量表达chZAP，从而可以有效降解禽白血病病毒的mRNA，解决了 ALV囊膜区 超突变逃逸免疫细胞攻击问题，为禽白血病的高效防治提供了新途径。 该ChZAP慢病毒重组载体含有chZAP N末端的基因序列。 其中所述的慢病毒慢病毒重组载体购自吉凯基因公司的过表达慢病毒。 为了获得上述的chZAP慢病毒重组载体，专利技术人首先首先禽CCCH型锌指蛋白的N 末端功能区保守序列设计合成了引物，其正向引物序列为5' -GAATTCAGCTTCCTCACCAAGACCC TC-3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，含EcoRl酶切位点，反向引物为5'-GCGGCCGCAG ATGGCTTCTGTTCTTTGCTACT-3'，含Notl酶切位点，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示； 获得上述引物之后，专利技术人以正常SPF鸡的肝、脾、肾及DF-I细胞的cDNA为模板 进行PCR扩增，结果发现所获得的核苷酸序列完全一致，从而获得chZAP N末端功能区的 保守序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。 之后专利技术人将该保守序列连接到GV208慢病毒载体，与pHelper 1.0载体和 pHelper 2.0载体分别进行高纯度无内毒素抽提（具体使用的是EndoFree Plasmid Midi Kit试剂盒，操作方法按照试剂盒说明进行），其中GV208慢病毒载体中含有HIV的基本元 件5' LTR和3' LTR以及其他辅助元件；pHelper 1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编 码病毒主要的结构蛋白；P〇l基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基 因表达的调节因子；pHelper 2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包 装所需要的包膜蛋白。将这三个载体重组后该病毒载体才具有转染性携带目的基因进入细 胞进行表达， 之后按Invitrogen公司Lipofectamine 2000使用说明进行共转染293T细胞，转 染后8h更换为完全培养基，培养48h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得 到高滴度的慢病毒浓缩液，在293T细胞中测定并标定病毒滴度。此慢病毒浓缩液即慢病毒 重组载体；通过慢病毒重组载体转染DF-I细胞将chZAP基因转入DF-I细胞基因组，从而使 chZAP在DF-I细胞中过量表达。 专利技术人通过体外检测的方式，证实过量表达的chZAP可以有效地降解J亚群禽白 血病病毒的mRNA，从而有效的抑制禽白血病病毒在细胞内的增殖。一般抑制效率达到70% 以上，较之现有的防治手法有着极大的进步。 综上所述，本专利技术提供了一种全新的来自于禽类的CCCH型锌指蛋白chZAP，并利 用该锌指蛋白获得了具有实际作用的慢病毒重组载体，通过chZAP的过量表达，有效的抑 制了逆转录病毒ALV-J的增殖，证实了 chZAP的抗禽白血病病毒作用，解决了 ALV囊膜区超 突变逃逸免疫细胞攻击问题，为禽白血病的高效防治提供了新途径，同时为J亚群禽白血 病的防治提供科学基础和技术支撑，降低养禽业因ALV-J感染造成的经济损失。 【专利附图】【附图说明】 图1为PCR法扩增禽不同器官获得的chZAP N末端基因电泳图； 图中 M为 DLlOOOMarker ;NL 为 Normal l本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种禽CCCH型锌指蛋白chZAP，其特征在于：编码该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：成子强，马晓倩，王永波，侯敏博，杨治聪，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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