一种环状瓜氨酸嵌合肽抗原及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种环状瓜氨酸嵌合肽抗原及其应用；该抗原的制备首先由来源于丝聚合蛋白/中间丝蛋白的瓜氨酸肽1、瓜氨酸肽2、瓜氨酸肽3三个小分子抗原肽通过甘氨酸连接嵌合而成，再通过在嵌合肽的N端及C端插入的两个半胱氨酸以形成二硫键，合成了一条具有与蛋白质β-转角结构相似的环状多肽。将该环状嵌合肽抗原包被在固相载体上，制成间接酶联免疫试剂盒，用于检测类风湿性关节炎（RA）血清中的多种抗瓜氨酸肽抗体亚型。本发明专利技术公布的环状多肽抗原及其ELISA试剂盒制备及实验操作过程简单，其对RA的检测敏感性和诊断价值较国际同类试剂盒显著提高，结果重复性好，并可定性或定量，具有广泛的临床应用和科学研究价值。

【技术实现步骤摘要】
一种环状瓜氨酸嵌合肽抗原及其应用
本专利技术属于临床免疫及医学实验诊断领域，具体涉及一种环状瓜氨酸嵌合肽抗原及其应用，设计合成一种能被多数类风湿性关节炎血清特异识别的环状瓜氨酸嵌合多肽(cyclicchimericcitrullinatedpeptide，CCCP)及其应用于检测相关抗体的酶联免疫试剂盒。
技术介绍
类风湿性关节炎（rheumatoidarthritis,RA）是一种常见的慢性自身免疫性疾病。在全世界大约有1%的人罹患此病。RA能引起关节的疼痛、僵直及肿胀。在发病1-2年内即可能出现不可逆的骨关节损伤，并可引起多种并发症。及早诊断RA及给予缓解病情的药物治疗，对控制病情时，改善预后非常重要（GabrielSE.Theepidemiologyofrheumatoidarthritis.RheumDisClinNorthAm27(2001)269-281）。目前诊断类风湿性关节炎是基于综合临床表现及实验检查的美国风湿病学会（ACR）的分类标准（TheAmericanRheumatismAssociation1987revisedcriteriafortheclassificationofrheumatoidarthritis.ArthritisRheum.1988;31:315–24.）。临床医生上在应用该标准规定的指标时受主观因素影响较大，加上疾病本身在个体上临床表现的多样性，经常出现误诊或漏诊。而由于缺乏高度敏感性或特异性的原因，当前尚无很理想的实验室检测指标。2000年，国外首次报道的抗环瓜氨酸肽（cycliccirullinatedpeptide,CCP）抗体的检测，对RA具有很高的特异性（›93%），明显优于传统的类风湿因子（RF），是实验诊断RA很有前途的血清标志物。后续的研究表明，CCP抗体不仅是RA早期诊断指标，而且是鉴别侵蚀性、非侵蚀性RA的灵敏指标（ShankarSetal.Roleofanticycliccitrullinatedpeptideantibodiesinerosivediseaseinpatientswithrheumatoidarthritis.IndianJMedRes.2006Dec;124(6):689-96.）。与CCP抗体阴性的患者相比，抗CCP抗体阳性的RA病人通常出现或易发展成更严重的关节骨质破坏。所以该血清标志物一经问世，就很受欢迎，现已在国际上得到广泛应用。但是，综合报道显示，抗CCP抗体对RA的敏感度仅在60%-72%，不及低特异性的RF（65%-85%），目前CCP仍无法完全替代RF及其它RA相关的自身抗体（TaylorPetal.Asystematicreviewofserumbiomarkersanti-cycliccitrullinatedPeptideandrheumatoidfactorastestsforrheumatoidarthritis.AutoimmuneDis.2011:815038）(BasSetal.Diagnostictestsforrheumatoidarthritis:comparisonofanti-cycliccitrullinatedpeptideantibodies,anti-keratinantibodiesandIgMrheumatoidfactors.Rheumatology(Oxford)2002;41:809–14.）。因此，为了减少漏诊率，临床医生仍需联合检测RF，抗CCP抗体或其它血清标志物，从而增加了病人的医疗负担。这样，提高RA患者血清中CCP抗体的检测敏感性，是摆在医学科研人员面前的一个重要任务。抗CCP抗体是风湿病自身抗体系统的一种，以IgG型为主。该抗体针对的抗原为丝聚合蛋白/中间丝蛋白（filaggrin）的多肽片段。应用基于filaggrin的cDNA序列而合成的多肽，Schellekens和GirbalNeuhause于1998年首先证实了瓜氨酸残基是类风湿关节炎特异的抗filaggrin抗体识别抗原表位的必需组成部分（SchellekensGAetal.Citrullineisanessentialconstituentofantigenicdeterminantsrecognizedbyrheumatoidarthritis-specificautoantibodies.JClinInvest1998;101:273–81.）。他们通过对各个序列号的filggrin氨基酸序列进行分析，合成了一条以瓜氨酸代替精氨酸的小分子肽链。并试验证明了该瓜氨酸小分子肽链能被一部分RA血清所高度特异识别。两年后，Schellekens的研究团队通过将一条瓜氨酸短肽中的丝氨酸替换为半胱氨酸，合成了环瓜氨酸肽（cycliccitrullinatedpeptide,CCP），并将其应用于检测RA患者血清中的抗环瓜氨酸肽抗体，敏感性得到了进一步的提高（SchellekensGAetal.Thediagnosticpropertiesofrheumatoidarthritisantibodiesrecognizingacycliccitrullinatedpeptide.ArthritisRheum2000;43:155–63.）。该技术一出现，立即备受关注，现已被多家国际主要的商品化的CCP试剂盒所采用。然而，临床评价实验表明，虽然这些CCP试剂盒对RA的特异性较高（90%-97%），但其敏感性（62-72%）仍待提高，综合诊断价值还不很理想(NishimuraKetal.Meta-analysis:diagnosticaccuracyofanti-cycliccitrullinatedpeptideantibodyandrheumatoidfactorforrheumatoidarthritis.AnnInternMed.2007Jun5;146(11):797-808）。目前商品化的CCP试剂盒的共同缺点是用于检测环瓜氨酸肽抗体的多肽抗原一般只含有单一的抗原表位，只能检出一部分瓜氨酸肽抗体亚型，而且不同厂家采用合成肽抗原的氨基酸序列不同，经常造成检测结果的差异，给临床医生对RA的诊断造成困扰。基于以上背景，我们的研究采用创新的思路，首先应用RA病人血清筛查出针对该病高度特异的几个优势抗原表位（瓜氨酸肽1，瓜氨酸肽2，瓜氨酸肽3），并发现不同RA病人的血清对这些抗原多肽的识别存在明显差异。如有些RA患者的血清只识别瓜氨酸肽1，部分血清只识别瓜氨酸肽2或瓜氨酸肽3，而有些类风湿性关节炎血清则能同时识别多种抗原决定簇（瓜氨酸肽1，瓜氨酸肽2，瓜氨酸肽3）。这样，如果与当前的商业化试剂盒一样，只采用含单一抗原表位的合成肽，必将漏检相当一部分瓜氨酸肽抗体亚型，客观上限制了检测敏感性的提高。而同时包被以上三条合成肽于ELISA板，由于短肽之间对有限包被位点的相互竞争，也对敏感性的提高造成技术上的困难。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种环状瓜氨酸嵌合肽抗原及其应用，设计合成一种对类风湿性关节炎具有高度特异并含有多个丝聚合蛋白/中间丝蛋白（filaggrin）优势抗原表位的环状瓜氨本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种环状瓜氨酸嵌合肽抗原，其特征在于：该抗原由来源于丝聚合蛋白/中间丝蛋白的瓜氨酸肽1、瓜氨酸肽2、瓜氨酸肽3三个小分子合成肽通过甘氨酸连接嵌合，再通过在嵌合肽的N端及C 端插入的半胱氨酸产生的二硫键， 从而形成了具有与蛋白质β‑转角相似结构的环状嵌合肽，其氨基酸序列如下：CXGGXQGSYHEQSVDXGHGQSGPXSASXQTXGGXXQDSSVVGXC，其中X 为瓜氨酸。

【技术特征摘要】
1.一种环状瓜氨酸嵌合肽抗原，其特征在于：该抗原由来源于丝聚合蛋白/中间丝蛋白的瓜氨酸肽1、瓜氨酸肽2、瓜氨酸肽3三个小分子合成肽通过甘氨酸连接嵌合，再通过在嵌合肽的N端及C端插入的半胱氨酸产生的二硫键，从而形成了具有与蛋白质β-转角相似结构的环状嵌合肽，其线性结构及氨基酸序列如下：CXGGXQGSYHEQSVDXGHGQSGPXSASXQTXGGXXQDSSVVGXC其中X为瓜氨酸。2.根据权利要求1所述的一种环状瓜氨酸嵌合肽抗原，其特征在于：所述多肽具有环状结构，其富含瓜氨酸残基的氨基酸序列包含了来源于丝聚合蛋白/中间丝蛋白中能被类风湿性关节炎特异识别的多个抗原表位。3.根据权利要求1所述的一种环状瓜氨酸嵌合肽抗原，其特征在于：线性瓜氨酸嵌合肽，瓜氨酸肽1、瓜氨酸肽2、瓜氨酸肽3的氨基酸序列如下：线性瓜氨酸嵌合肽：XGGXQGSYHEQSVDXGHGQSGPXSASXQTXGGXXQDSSVVGX；瓜氨酸肽1：XGGXQGSYHEQSVDX；瓜氨酸肽2：HGQSGPXSASXQTX；瓜氨酸肽3：GXXQDSSVVGX。4.根据权利要求1所述的一种环状瓜氨酸嵌合肽抗原，其特征在于：各瓜氨酸合成肽段序列来源于丝聚合蛋白/中间丝蛋白，由FMOC固相合成方法自动或人工合成，经高效液相色谱法分析和纯化，抗原纯度达到90%以上。5.一种如权利要求1所述的环状瓜氨酸嵌合肽抗原在抗体检测试剂中的应用，其特征在于：将环状瓜氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈仁奋，魏秀妹，
申请(专利权)人：陈仁奋，
类型：发明
国别省市：福建;35