一种蝎源抗菌肽IsCT在毕赤酵母中的表达方法及其在临床上治疗感染性外伤的应用技术

本发明专利技术公开了一种蝎源抗菌肽IsCT在毕赤酵母中的表达方法及其在临床上治疗感染性外伤的应用，所述蝎源抗菌肽IsCT在毕赤酵母中的表达方法，步骤为：含IsCT目的片段的获得；多拷贝IsCT衍生物重组质粒的构建；毕赤酵母分泌表达IsCT衍生物重组质粒的构建；重组毕赤酵母的构建和筛选；重组菌的摇瓶发酵诱导表达。本发明专利技术综合多项因素，采用巴斯德毕赤酵母表达系统，选用分泌型表达载体pPICZαA和Mut+型宿主菌X-33，进行分泌表达蝎源抗菌肽IsCT衍生物，并对体外分泌表达产物进行抑菌活性检测，为其在临床上治疗外伤类感染类疾病提供理论基础及技术支持。

【技术实现步骤摘要】
一种蝎源抗菌肽IsCT在毕赤酵母中的表达方法及其在临床上治疗感染性外伤的应用
本专利技术属于抗菌肽领域，具体是一种蝎源抗菌肽IsCT在毕赤酵母中的表达方法及其在临床上治疗感染性外伤的应用。
技术介绍
抗生素的发现是化学治疗药物史上最重要的发现之一，它极大地降低了感染性疾病的死亡率。然而，抗生素的大量使用，尤其是不合理使用导致了日益严重的抗生素耐受现象。耐药菌，尤其是多药物耐受菌，已成为威胁公共安全的重大问题，也导致了对新型抗感染药物的需求越来越迫切。自从发现cecropin以来，抗菌肽的研究备受关注，目前已经鉴别的抗菌肽超过2000种，几乎来源于从微生物到哺乳动物所有种类的生物。抗菌肽研究的角度也得到极大的扩展，从作用机理、产生机制到挖掘抗菌肽其他功能，如免疫调节、离子调节、抗氧化功能等，再到临床应用研究。抗菌肽是由基因编码、核糖体合成的，是宿主先天性免疫防御系统产生的一类抵抗外界病原体感染的小分子阳离子肽类生物活性物质，是先天性免疫的重要效应分子。1.IsCT是一种天然的α-螺旋抗菌肽，来源于马达加斯加黑爪蝎（Opisthacanthusmadagascariensis），是抗菌肽中最短的多肽，仅由13个氨基酸残基（ILGKIWEGIKSLF）组成，没有半胱氨酸。IsCT对哺乳动物和细菌细胞都有活性。基于这个基因设计的IsCT衍生物中的[L6,K11]-IsCT（ILGKILKGIKKLF）中与IsCT一样，对E.coli,P.aeruginosa,S.trphimurium,S.epidermidis,S.aureus有相同的抑菌活性，同时当[L6,K11]-IsCT浓度达到100μM时的溶血活性仅为20%，因此在饲料、医药中有较高的应用价值。2.抗菌肽是生物内在免疫的效应分子，在生物体内含量甚微，从天然资源中提取成本高、得率低、工序繁琐，所以不可能通过从生物体内直接提取大量抗菌肽的方式来满足商业化的生产，目前主要的两种方式是直接合成多肽和基因工程手段。而化学合成价格昂贵，也难以应用于临床；因此利用基因工程技术生产抗菌肽具有重要的意义。抗菌肽重组表达研究始于20世纪80年代中期，至今已经取得相当多的研究成果，具备了一定的理论和技术基础。由于抗菌肽分子量小，且可能对宿主菌有毒性，因此在大肠杆菌中抗菌肽单独表达的报告并不多且表达量不高。巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）是近几年发展起来的较为完善的、被广泛用来表达外源蛋白的甲醇营养型酵母表达系统，目前通过毕赤酵母表达了很多不同种类的蛋白。因此选择用毕赤酵母作为表达IsCT衍生物的宿主。在毕赤酵母中生产重组蛋白有优于其他真核生物和原核生物的特点：1.便于基因工程操作，具有强有力的乙醇氧化酶（AOX1）基因启动子，可严格调控外源基因的表达；2.作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰；从而使表达出的蛋白具有生物活性；3.营养要求低、生长快、培养基廉价，便于工业化生产；4.可高密度发酵培养，表达量高；5.在毕赤酵母中表达的蛋白既可存在于细胞内，又可分泌到胞外，自身分泌的蛋白非常少，有利于纯化；6.糖基化程度低，与酿酒酵母相比，毕赤酵母不产生过度的糖基化；7.可通过重组基因多拷贝整合增加所需蛋白的表达量。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种蝎源抗菌肽IsCT在毕赤酵母中的表达方法及其在临床上治疗感染性外伤的应用。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种蝎源抗菌肽IsCT在毕赤酵母中的表达方法，包括以下步骤：（1）含IsCT目的片段的获得以α信号肽为模板设计引物，上游引物：5′GCGTTCGAAACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTAC3′，下游引物：5′CCGGAATTCTTAAAACAACTTCTTAATACCCTTCAAAATCTTACCCAAAATTCTTTTAGCTTCAGCCTCTCTTTTC3′，其中TTCGAA为BstBⅠ的酶切位点；GAATTC为EcoRⅠ的酶切位点，目的基因设计在下游引物上，以质粒pPICZαA为模板，PCR扩增得到含有目的基因和α信号肽的片段；将PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化；（2）多拷贝IsCT衍生物重组质粒的构建单拷贝重组质粒pPICZαA-IsCT用BglⅡ和BamHⅠ双酶切后，将双酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分离，切胶后回收表达盒段并纯化；同时用BamHⅠ线性化质粒pPICZαA-IsCT，并去磷酸化后，用T4连接酶连接，得到二拷贝质粒pPICZαA-(IsCT)2，重复这个过程，得到更多拷贝数的IsCT衍生物；（3）毕赤酵母分泌表达IsCT衍生物重组质粒的构建质粒pPICZαA和含有目的基因的片段同时用BstBⅠ和EcoRⅠ双酶切，构建重组质粒pPICZαA-IsCT；然后用CaCl2法转入E.coli感受态细胞，在Zeocin+LBL平板上涂板，过夜培养；提取阳性转化子质粒进行BstBⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定；（4）重组毕赤酵母的构建和筛选以MssⅠ线性化重组质粒pPICZαA-IsCT，采用电转化宿主菌P.pastorisX33于Zeocin+YPDS平板上涂板，28-32℃培养2-3d，随机挑选转化子进行菌落PCR鉴定；（5）重组菌的摇瓶发酵诱导表达将筛选得到的重组转化子X33/pPICZαA-IsCT接种于10mLBMGY培养基中，30℃，200r/mim震荡培养16-20h至OD600=2-6；离心收集菌体，再将X33/pPICZαA-IsCT悬浮于25mLBMMY培养基中，并使起始OD600=1，继续震荡培养，每隔24h向BMMY培养基中补加1%的甲醇，得到重组菌，即为蝎源抗菌肽IsCT衍生物，并分析重组菌的生长曲线和IsCT衍生物的抗菌活性。作为进一步的方案：步骤（1）中用于PCR扩增的PCR反应体系为：引物各10pmol/L，PremixprimeSTAR25μL，模板1μL，加无菌水至总体积为50μL；反应条件为：98℃5min;98℃10s，55℃10s，72℃20s，30个循环；72℃10min；将PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化。所述的蝎源抗菌肽IsCT在毕赤酵母中的表达方法制备的蝎源抗菌肽IsCT衍生物在治疗外伤类感染类疾病的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术综合多项因素，采用巴斯德毕赤酵母表达系统，选用分泌型表达载体pPICZαA和Mut+型宿主菌X-33，进行分泌表达蝎源抗菌肽IsCT衍生物，并对体外分泌表达产物进行抑菌活性检测，为其在临床上治疗外伤类感染类疾病提供理论基础及技术支持。附图说明图1为重组质粒pPICZαA-IsCT的示意图；图2为单拷贝重组质粒双酶切凝胶电泳图；图2中：M:DNAMarker;1:重组质粒经BstBⅠ和EcoRⅠ双酶切；图3为二拷贝重组质粒单双酶切凝胶电泳图；图4为三拷贝重组质粒单双酶切电泳图；图3和图4中：M：DNAMarker；1：二拷贝（图3）及三拷贝（图4）重组质粒经BgIⅡ和BamHⅠ双酶切双酶切；2、3：二拷贝（图3）及三拷贝（图4）重组质粒单酶切；图5为单拷贝重组毕赤酵母发酵120h后对S.aureusATCC25923的抑制实验本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蝎源抗菌肽IsCT在毕赤酵母中的表达方法，其特征在于，包括以下步骤： （1）含IsCT目的片段的获得以α信号肽为模板设计引物，上游引物：5′GCGTTCGAAACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTAC 3′，下游引物：5′CCGGAATTCTTAAAACAACTTCTTAATACCCTTCAAAATCTTACCCAAAATTCTTTTAGCTTCAGCCTCTCTTTTC 3′，其中TTCGAA为BstBⅠ的酶切位点；GAATTC为EcoRⅠ的酶切位点，目的基因设计在下游引物上，以质粒pPICZαA为模板，PCR扩增得到含有目的基因和α信号肽的片段；将PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化；（2）多拷贝IsCT衍生物重组质粒的构建  单拷贝重组质粒pPICZαA‑IsCT用BglⅡ和BamHⅠ双酶切后，将双酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分离，切胶后回收表达盒段并纯化；同时用BamHⅠ线性化质粒pPICZαA‑IsCT，并去磷酸化后，用T4连接酶连接，得到二拷贝质粒pPICZαA‑(IsCT)2，重复这个过程，得到更多拷贝数的IsCT衍生物；（3）毕赤酵母分泌表达IsCT衍生物重组质粒的构建  质粒pPICZαA和含有目的基因的片段同时用BstBⅠ和EcoRⅠ双酶切，构建重组质粒pPICZαA‑IsCT；然后用CaCl2法转入E. coli感受态细胞，在Zeocin+ LBL平板上涂板，过夜培养；提取阳性转化子质粒进行BstBⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定；（4）重组毕赤酵母的构建和筛选 以MssⅠ线性化重组质粒pPICZαA‑IsCT，采用电转化宿主菌P. pastoris X33于Zeocin+ YPDS平板上涂板，28‑32℃培养2‑3d，随机挑选转化子进行菌落PCR鉴定；（5）重组菌的摇瓶发酵诱导表达 将筛选得到的重组转化子X33/pPICZαA‑IsCT接种于10mL BMGY培养基中，30℃，200r/mim震荡培养16‑20h至OD600=2‑6；离心收集菌体，再将X33/pPICZαA‑IsCT悬浮于25mL BMMY培养基中，并使起始OD600=1，继续震荡培养，每隔24h向BMMY培养基中补加1%的甲醇，得到重组菌，即为蝎源抗菌肽IsCT衍生物，并分析重组菌的生长曲线和IsCT衍生物的抗菌活性。...

【技术特征摘要】
1.一种蝎源抗菌肽IsCT在毕赤酵母中的表达方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)含IsCT目的片段的获得以α信号肽为模板设计引物，上游引物：5′GCGTTCGAAACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTAC3′，下游引物：5′CCGGAATTCTTAAAACAACTTCTTAATACCCTTCAAAATCTTACCCAAAATTCTTTTAGCTTCAGCCTCTCTTTTC3′，其中TTCGAA为BstBⅠ的酶切位点；GAATTC为EcoRⅠ的酶切位点，目的基因设计在下游引物上，以质粒pPICZαA为模板，PCR扩增得到含有目的基因和α信号肽的片段；将PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化；(2)多拷贝IsCT衍生物重组质粒的构建单拷贝重组质粒pPICZαA-IsCT用BglⅡ和BamHⅠ双酶切后，将双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分离，切胶后回收表达盒段并纯化；同时用BamHⅠ线性化质粒pPICZαA-IsCT，并去磷酸化后，用T4连接酶连接，得到二拷贝质粒pPICZαA-(IsCT)2，重复这个过程，得到更多拷贝数的IsCT衍生物；(3)毕赤酵母分泌表达IsCT衍生物重组质粒的构建质粒pPICZαA和含有目的基因的片段同时用BstBⅠ和EcoRⅠ双酶切，构建重组质粒pPICZαA-IsCT；然后用CaCl2法转入E...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘韵，陈义昆，郑文官，侯雅君，唐明辉，李永新，
申请(专利权)人：深圳市圣西马生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44