一种富含叶酸食药真菌发酵产物的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种富含叶酸食药真菌发酵产物的制备方法，包括：将活化的桑黄和灵芝菌种接种于添加黄连木提取物的液体种子培养基中培养制得桑黄和灵芝液体菌种；先将桑黄液体菌种接入添加有胡萝卜、大麦的固体培养基中培养，培养产物干燥粉碎后得固体培养物Ⅰ；再将灵芝液体菌种接入添加有固体培养物Ⅰ和甘蓝酶解物的液体发酵培养基中培养，培养一段时间再接入乳酸菌菌种进行培养得到发酵产物。本发明专利技术根据胡萝卜、甘蓝传统富含叶酸果蔬原料特点及食药真菌桑黄、灵芝的发酵特性，通过采用先食药真菌发酵，后乳酸菌发酵的两阶段发酵，提高了最终发酵产物中叶酸的含量，是一种极具工业化前景的生产方法。

【技术实现步骤摘要】
一种富含叶酸食药真菌发酵产物的制备方法
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种富含叶酸食药真菌发酵产物的制备方 法。
技术介绍
桑黄（Phellinus igniarius)属担子菌亚门，层孔菌纲，锈革孔菌科，针层孔菌属。 桑黄菌提取物在抑制癌细胞转移和防止癌症手术后复发等的临床应用中具有显著效果，是 目前国际公认的生物治癌药剂中有效率最高的一种食药真菌。 由于受生理状态的特殊性和复杂性以及外部环境的制约，造成桑黄在自然界中形 成子实体稀少，特别是形成可用子实体需要多年。而且人工栽培极其困难，培养条件苛刻， 且生长周期长达3-4年，难以满足日益膨胀的市场需要。采用桑黄液体发酵的方法生产桑 黄药用活性成分因为具有生产周期短、劳动力省以及受外部环境影响小等优点被认为是一 种有效的方法。目前，国内外对桑黄菌丝体培养生产活性药用成分研究和工艺应用主要集 中在发酵条件及产物提取分离等层面上，整体发酵水平不高。 叶酸（folate)属于水溶性维生素 B族，是具有蝶酰谷氨酸分子结构的一类化合物 的总称，又名蝶酰谷氨酸，维生素 Be、维生素 M、维生素 B11。叶酸的重要生理功用是作为一 碳化合物的载体参加代谢活动。叶酸转化为四氢叶酸衍生物以辅酶形式作为一碳单位的载 体，对转移甲基和利用甲酸基及甲醛都有重要功用。叶酸在核酸和蛋白质生物合成过程中 也具有重要作用。由于人体内无法自主合成叶酸，几乎完全依赖于食物摄入，因此当摄入量 不足或利用率降低时，体内便会出现叶酸缺乏的症状。近年的研究表明，叶酸缺乏与巨幼红 细胞性贫血有关，还与儿童智力低下、神经管畸形、心脑血管疾病、某些癌症（如子宫颈癌、 结肠癌、支气管癌和食管癌）等有关。叶酸缺乏可导致胎儿神经管畸形、巨幼红细胞性贫 血，且与心血管疾病、老年性痴呆、直肠癌及子宫颈癌密切相关。膳食叶酸对人类至关重要， 这是因为哺乳动物细胞不能合成叶酸，但组织的生长需要大量叶酸。植物和微生物可以合 成叶酸，是膳食叶酸的重要来源，如植物中的甘蓝、柑橘、大麦、扁豆等。 基于叶酸对人体健康的重要程度不断增加，叶酸的开发与应用成为当今世界强化 食品研究与开发的新热点。天然叶酸的主要来源是绿色植物的叶子、动物肝脏、蛋黄、大豆、 小麦和以叶酸发酵产生的早餐谷物类及酵母当中。市售的叶酸以化学合成为主，但化学合 成的叶酸和天然叶酸在人体内的代谢不尽相同，摄入过多的人工叶酸，会引起不良作用，t匕 如减弱巨噬细胞的吞噬作用，甚至会促进部分癌细胞的生长。而微生物发酵产生的叶酸质 量安全，不会给人体带来副作用。
技术实现思路
本专利技术提供了一种富含叶酸食药真菌发酵产物的制备方法，该方法操作容易，转 化率高,可明显提高发酵产物中叶酸含量。 本专利技术采用的技术方案是： -种富含叶酸食药真菌发酵产物的制备方法，包括步骤： (1)食药真菌液体种子液制备：取活化后的桑黄菌种接种于添加黄连木提取物的 桑黄液体种子培养基中培养3天-10天，得到桑黄液体菌种；取活化后的灵芝菌种接种于添 加黄连木提取物的灵芝液体种子培养基中培养3天-10天，得到灵芝液体菌种； (2)固体发酵培养：将步骤（1)中的桑黄液体菌种按占胡萝卜固体发酵培养基体 积8% -20%的用量接入胡萝卜固体发酵培养基中，在22°C -30°C下培养3天-15天后，将 培养产物真空冷冻干燥、粉碎后得胡萝卜固体培养物I ;所述的胡萝卜固体发酵培养基中 含有胡萝卜和大麦； (3)液体发酵培养：将步骤（1)中的灵芝液体菌种按占液体发酵培养基体积 4% -15 %的用量先接入液体发酵培养基中，在22°C -28°C下培养1天-6天后，调pH值为 4. 0-6. 8,升温至35°C -37°C并保持在该温度下2h-2. 5h后，再接入占液体发酵培养基体 积2% -12%的乳酸菌液体菌种培养6h-48h，终止发酵后，得到富含叶酸的食药真菌发酵产 物；所述的液体发酵培养基含有胡萝卜固体培养物I和甘蓝酶解物。 本专利技术根据胡萝卜、甘蓝传统富含叶酸果蔬原料特点及食药真菌桑黄、灵芝的发 酵特性，利用食药真菌具有降解纤维素、果胶、淀粉等物质的酶系，可将纤维素、果胶等分解 为更易被微生物利用的小分子碳源，提高了最终发酵产物中叶酸的含量。 所述的桑黄菌种可采用任意一种桑黄菌种，可采用市售产品。例如桑黄 (Phellinus linteus)ACCC51181菌种，来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心。 所述的灵芝菌种可采用任意一种灵芝菌种，可采用市售产品。例如灵芝 (Ganoderma lucidium)ACCC 51515菌种，来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心。 为了达到更好的专利技术效果，进行以下优选： 步骤（1)中，每升桑黄液体种子培养基中黄连木提取物的添加量为Ig-IOg ;每升 灵芝液体种子培养基中黄连木提取物的添加量为lg-10g。 所述的黄连木提取物可以选用市售产品，也可以采用现有方法制备；优选以黄连 木树叶为原料制备的黄连木提取物，进一步优选由黄连木树叶乙醇提取物和黄连木树叶水 提取物组成的黄连木提取物，可采用以下制备方法制备的黄连木提取物，包括：称取一定量 的黄连木树叶，粉碎（优选过40目-100目），先加占黄连木树叶重量10倍量-16倍量的质 量百分浓度为60% -80%的乙醇水溶液在60°C -80°C浸提lh-2h，过滤后得到上清液，上清 液浓缩后真空冷冻干燥得提取物II ;上述醇提后的黄连木树叶残渣加入占黄连木树叶重量 10倍量-20倍量的水在85°C -95°C下浸提lh-2. 5h，过滤后得到上清液，上清液浓缩至1/4 体积后加入浓缩物体积2倍量-5倍量的无水乙醇，离心收集沉淀物，沉淀物真空冷冻干燥 后得提取物III，合并上述提取物II和提取物III得黄连木提取物。 步骤（1)中，所述的活化后的桑黄菌种、活化后的灵芝菌种在添加黄连木提取物 的液体种子培养基中培养的温度为自然环境温度，优选为20°C -30°C。一般IL添加黄连木 提取物的液体种子培养基中接入lcm2-4cm2大小的活化后的桑黄菌种菌块或活化后的灵芝 囷种囷块。 步骤（1)中，桑黄菌种、灵芝菌种的活化方法为本领域常规的菌种活化方法，包 括：将斜面保藏的桑黄菌种、灵芝菌种分别接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养 温度22°C _30°C，培养时间3天-10天，分别得到活化后的桑黄菌种、活化后的灵芝菌种。 所述的PDA平板培养基和液体种子培养基均采用本领域种子培养常用的培养基， 可采用市售产品。进一步优选，所述的PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂 15g-20g，用水定容至1000mL。进一步优选，所述的桑黄液体种子培养基：葡萄糖5g-20g、酵 母粉4g、蛋白胨3g、KH 2PO4Ig和MgSO4O. 5g，用水定容至1000mL。所述的灵芝液体种子培养 基：葡萄糖8g-25g、酵母粉6g、蛋白胨6g、KH2PO 4Ig和MgSO4O. 5g，用水定容至1000mL。 步骤（2)中，所述的胡萝卜固体发酵培养基优选由以下质量百分比的组分组成： K2HPO4O. 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种富含叶酸食药真菌发酵产物的制备方法，其特征在于，包括步骤：(1)食药真菌液体种子液制备：取活化后的桑黄菌种接种于添加黄连木提取物的桑黄液体种子培养基中培养3天‑10天，得到桑黄液体菌种；取活化后的灵芝菌种接种于添加黄连木提取物的灵芝液体种子培养基中培养3天‑10天，得到灵芝液体菌种；(2)固体发酵培养：将步骤(1)中的桑黄液体菌种按占胡萝卜固体发酵培养基体积8％‑20％的用量接入胡萝卜固体发酵培养基中，在22℃‑30℃下培养3天‑15天后，将培养产物真空冷冻干燥、粉碎后得胡萝卜固体培养物Ⅰ；所述的胡萝卜固体发酵培养基中含有胡萝卜和大麦；(3)液体发酵培养：将步骤(1)中的灵芝液体菌种按占液体发酵培养基体积4％‑15％的用量先接入液体发酵培养基中，在22℃‑28℃下培养1天‑6天后，调pH值为4.0‑6.8，升温至35℃‑37℃并保持在该温度下2h‑2.5h后，再接入占液体发酵培养基体积2％‑12％的乳酸菌液体菌种培养6h‑48h，终止发酵后，得到富含叶酸的食药真菌发酵产物；所述的液体发酵培养基含有胡萝卜固体培养物Ⅰ和甘蓝酶解物。

【技术特征摘要】
1. 一种富含叶酸食药真菌发酵产物的制备方法，其特征在于，包括步骤： (1) 食药真菌液体种子液制备：取活化后的桑黄菌种接种于添加黄连木提取物的桑黄 液体种子培养基中培养3天-10天，得到桑黄液体菌种；取活化后的灵芝菌种接种于添加黄 连木提取物的灵芝液体种子培养基中培养3天-10天，得到灵芝液体菌种； (2) 固体发酵培养：将步骤（1)中的桑黄液体菌种按占胡萝卜固体发酵培养基体积 8% -20%的用量接入胡萝卜固体发酵培养基中，在22°C _30°C下培养3天-15天后，将培养 产物真空冷冻干燥、粉碎后得胡萝卜固体培养物I ;所述的胡萝卜固体发酵培养基中含有 胡萝卜和大麦； (3) 液体发酵培养：将步骤（1)中的灵芝液体菌种按占液体发酵培养基体积4% -15% 的用量先接入液体发酵培养基中，在22°C -28°C下培养1天-6天后，调pH值为4. 0-6. 8,升 温至35 °C -37 °C并保持在该温度下2h-2. 5h后，再接入占液体发酵培养基体积2% -12 %的 乳酸菌液体菌种培养6h-48h，终止发酵后，得到富含叶酸的食药真菌发酵产物；所述的液 体发酵培养基含有胡萝卜固体培养物I和甘蓝酶解物。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤⑴中，每升桑黄液体种子培养 基中黄连木提取物的添加量为lg-l〇g ;每升灵芝液体种子培养基中黄连木提取物的添加 量为 lg-l〇g。3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的黄连木提取物为以黄连木树 叶为原料制备的黄连木提取物。4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的黄连木提取物由黄连木树叶 醇提取物和黄连木树叶水提取物组成。5. 根据权利要求1或3所述的制备方法，其特征在于，所述的黄连木提取物的制备方 法，包括：称取一定量的黄连木树叶，粉碎，先加占黄连木树叶重量10倍量-16倍量的质量 百分浓度为60% -80%的乙醇水溶液在60°C -80°C浸...

【专利技术属性】
技术研发人员：程俊文，贺亮，胡传久，魏海龙，付立忠，李海波，
申请(专利权)人：浙江省林业科学研究院，
类型：发明
国别省市：浙江;33