一种苦石莲悬浮细胞培养的快速繁殖方法技术

本发明专利技术研究了一种苦石莲悬浮细胞培养的快速繁殖方法，包括无菌叶片的获得、愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖、悬浮细胞的培养及条件的优化等步骤，本发明专利技术方法所制备的苦石莲悬浮细胞增殖系数高，生长周期短，次生代谢物含量高，为苦石莲药用成分的开发和利用提供新的途径。

【技术实现步骤摘要】
一种苦石莲悬浮细胞培养的快速繁殖方法
本专利技术涉及苦石莲悬浮细胞培养的快繁方法，属于生物
。
技术介绍
苦石莲，Caesalpinia minax又称为石莲子、老鸦枕头、土石莲子,豆科,有刺藤本，全株被短柔毛。2回双数羽状复叶，羽片5?8对，托叶锥状；小叶12?24枚，近无柄，矩形或倒卵形，长约1.6?3.5厘米，阔0.8?1.2厘米，先端急尖成细尖，基部圆形，全缘。分布广东、广西、四川、云南等地。药材主产云南、广西。此外，广东、四川、江西、福建等地亦产，生于山沟中空旷的溪旁、路边或灌木丛中。主产云南、广西。此外，广东、四川、江西、福建等地亦产，该植物的根、苗亦供药用性苦寒，有散瘀，止痛，清热，去湿的功效，目前主要是野外采集。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供石莲悬浮细胞增殖系数高，生长周期短，次生代谢物含量高，为苦石莲药用成分的开发和利用提供新的途径。 为解决上述技术问题，本专利技术采用下列技术方案:取苦石莲幼嫩叶片，在肥皂水中浸泡5min，流水冲洗25min，超净工作台上0.1%氯化汞处理lOmin，无菌水冲洗7遍，吸水纸吸去表面水分，消毒处理过的叶片接入ER+NAA0.05mg/L+6-BA5.0mg/L+IBA0.25mg/L+2, 4-D1.0mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加7g/L琼脂，30g/L葡萄糖，ΙΟΟΟΙχ，温度23°C，湿度50%，诱导出来的愈伤组织，接入ER+NAA2.0mg/L+6-BA3.0mg/L +2，4-D3.0mg/L+NAA2.0mg/L+巯基乙醇3_5ml/L培养基中进行愈伤组织增殖，附加7g/L琼脂，30g/L葡萄糖，20001x，温度23°C，湿度50%，取生长良好，长势均一的愈伤组织，称取 0.3g 加入 ER+2，4-D3.0mg/L+KT0.lmg/L+ 对氨基苯甲酸 80-100mg/L+0.35%琼脂+20g/L葡萄糖培养基中水平震荡培养，震荡速度90r/min，每60ml细胞悬浮液装入150ml三角瓶中培养，温度26°C，光照20001x，培养一定时间后，取出样品，用滤纸吸干细胞表面水分。 采用本专利技术制备的苦石莲悬浮细胞长势好，生长周期短，次生代谢物含量高。 下面将结合【具体实施方式】对本专利技术作进一步阐述，但本专利技术要求保护的范围并不局限于下列实施方式。 【具体实施方式】 实施例1取苦石莲幼嫩叶片，在肥皂水中浸泡5min，流水冲洗25min，超净工作台上0.1%氯化汞处理lOmin，无菌水冲洗7遍，吸水纸吸去表面水分，消毒处理过的叶片接入ER+NAA0.05mg/L+6-BA5.0mg/L+IBA0.25mg/L+2, 4-D1.0mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加7g/L琼月旨，30g/L葡萄糖，100lx,温度23°C，湿度50%，诱导出来的愈伤组织，接入ER+NAA2.0mg/L+6-BA3.0mg/L +2，4-D3.0mg/L+NAA2.0mg/L+巯基乙醇4ml/L培养基中进行愈伤组织增殖，附加7g/L琼脂，30g/L葡萄糖，20001x，温度23°C，湿度50%，取生长良好，长势均一的愈伤组织，称取0.3g加入ER+2，4-D3.0mg/L+KT0.lmg/L+对氨基苯甲酸90mg/L+(X 35%琼脂+20g/L葡萄糖培养基中水平震荡培养，震荡速度90r/min，每60ml细胞悬浮液装入150ml三角瓶中培养，温度26°C，光照20001x，培养一定时间后，取出样品，用滤纸吸干细胞表面水分，增长率47%。 实施例2取苦石莲幼嫩叶片，在肥皂水中浸泡5min，流水冲洗25min，超净工作台上0.1%氯化汞处理lOmin，无菌水冲洗7遍，吸水纸吸去表面水分，消毒处理过的叶片接入ER+NAA0.05mg/L+6-BA5.0mg/L+IBA0.25mg/L+2, 4-D1.0mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加7g/L琼脂，30g/L葡萄糖，ΙΟΟΟΙχ，温度23°C，湿度50%，诱导出来的愈伤组织，接入ER+NAA2.0mg/L+6-BA3.0mg/L +2，4-D3.0mg/L+NAA2.0mg/L+巯基乙醇3ml/L培养基中进行愈伤组织增殖，附加7g/L琼脂，30g/L葡萄糖，20001x，温度23°C，湿度50%，取生长良好，长势均一的愈伤组织，称取0.3g加入ER+2，4-D3.0mg/L+KT0.lmg/L+对氨基苯甲酸80mg/L+(X 35%琼脂+20g/L葡萄糖培养基中水平震荡培养，震荡速度90r/min，每60ml细胞悬浮液装入150ml三角瓶中培养，温度26°C，光照20001x，培养一定时间后，取出样品，用滤纸吸干细胞表面水分，增长率45%。 实施例3取苦石莲幼嫩叶片，在肥皂水中浸泡5min，流水冲洗25min，超净工作台上0.1%氯化汞处理lOmin，无菌水冲洗7遍，吸水纸吸去表面水分，消毒处理过的叶片接入ER+NAA0.05mg/L+6-BA5.0mg/L+IBA0.25mg/L+2, 4-D1.0mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加7g/L琼脂，30g/L葡萄糖，ΙΟΟΟΙχ，温度23°C，湿度50%，诱导出来的愈伤组织，接入ER+NAA2.0mg/L+6-BA3.0mg/L +2，4-D3.0mg/L+NAA2.0mg/L+巯基乙醇5ml/L培养基中进行愈伤组织增殖，附加7g/L琼脂，30g/L葡萄糖，20001x，温度23°C，湿度50%，取生长良好，长势均一的愈伤组织，称取0.3g加入ER+2，4-D3.0mg/L+KT0.lmg/L+对氨基苯甲酸100mg/L+0.35%琼脂+20g/L葡萄糖培养基中水平震荡培养，震荡速度90r/min，每60ml细胞悬浮液装入150ml三角瓶中培养，温度26°C，光照20001x，培养一定时间后，取出样品，用滤纸吸干细胞表面水分，增长率42%。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种苦石莲悬浮细胞培养的快速繁殖方法，包括无菌叶片的获得、愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖、悬浮细胞的培养及条件的优化，其主要步骤如下：（1）取苦石莲幼嫩的叶片，在超净工作台上对其进行消毒处理；（2）取步骤（1）消毒处理过的叶片接入ER+NAA0.05mg/L+6‑BA5.0mg/L+IBA0.25mg/L+2,4‑D1.0mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加7g/L琼脂，30g/L葡萄糖，1000lx，温度23℃，湿度50%；（3）取步骤（2）诱导出来的愈伤组织，接入ER+NAA2.0mg/L+6‑BA3.0mg/L +2,4‑D3.0mg/L+NAA2.0mg/L+巯基乙醇3‑5ml/L培养基中进行愈伤组织增殖，附加7g/L琼脂，30g/L葡萄糖，2000lx，温度23℃，湿度50%；（4）取步骤（3）生长良好，长势均一的愈伤组织，称取0.3g加入ER+2,4‑D3.0mg/L+KT0.1mg/L+对氨基苯甲酸80‑100mg/L+0.35%琼脂+20g/L葡萄糖培养基中震荡培养，培养一定时间后，取出样品，用滤纸吸干细胞表面水分。

【技术特征摘要】
1.一种苦石莲悬浮细胞培养的快速繁殖方法，包括无菌叶片的获得、愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖、悬浮细胞的培养及条件的优化，其主要步骤如下: (I)取苦石莲幼嫩的叶片，在超净工作台上对其进行消毒处理； (2 )取步骤(I)消毒处理过的叶片接入 ER+NAA0.05mg/L+6-BA5.0mg/L+IBA0.25mg/L+2, 4-D1.0mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加7g/L琼脂，30g/L葡萄糖，ΙΟΟΟΙχ，温度23。。，湿度 50% ； (3)取步骤(2)诱导出来的愈伤组织，接入ER+NAA2.0mg/L+6-BA3.0mg/L +2，4-D3.0mg/L+NAA2.0mg/L+巯基乙醇3_5ml/L培养基中进行愈伤组织增殖，附加7g/L琼脂，30g/L葡萄糖，20001x，温度 23。。，湿度 50% ； (4)取步骤(3)生长良好，长势均一的愈伤组织，称取0.3g加入ER+2，4-D3.0mg/L+KT0.lmg/L+对氨基苯甲酸80-100mg/L...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨存，
申请(专利权)人：南京通泽农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32