一种淀粉酶与其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术涉及两种淀粉酶蛋白及其编码基因，以及该蛋白作为淀粉水解酶在工业领域的应用。本发明专利技术以深海热液口来源样品Fosmid文库进行454测序后得到的Fosmid文库基因信息片段的注释信息为研究材料，从宏基因组文库筛选到对应淀粉酶基因簇中对应克隆子F_135，并对该Fosmid克隆子进行鸟枪法结合引物步移法测序和ORF预测，得到编码淀粉酶的基因序列，其DNA序列如序列表SEQ ID NO.1所示。将目的基因插入载体pET-32a(+)表达载体中，表达纯化得到该基因编码的多肽其成熟肽，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2序列所示。对其所具有的酶活性质进行了初步研究。本发明专利技术的淀粉酶，由于其特有的活性及酶学特性，可应用于与淀粉水解相关的工业化生产中。

【技术实现步骤摘要】
一种淀粉酶与其编码基因和应用
本专利技术涉及基因工程领域，特别是涉及一种淀粉酶与其编码基因及其应用。
技术介绍
淀粉酶是一类能将淀粉分子水解为由葡萄糖组成的多聚体分子的酶，它被发现广 泛分布于动物、植物和微生物有机体中。淀粉酶构成了工业酶的一大类，大约占有酶市场 25%的份额，随着技术的发展，淀粉酶的应用范围从传统的淀粉降解、纺织、食品、发酵、造 纸、酿造和蒸馏等工业领域，扩展到了临床、医药和分析化学等领域。 酶是一种生物催化剂，周围环境（温度、pH、有机试剂等）对它的活性影响很大，很 多酶在一些比较苛刻的反映条件下（高温、低温或者强酸碱环境）均会失去活性，这就限制 了其应用范围。为了适应更苛刻的工业生产环境需求，需要我们在尊重生物多样性的前提 条件下，不断在环境中进行新的淀粉酶来源的探索。 深海热液口烟囱是通过来自地壳的熔浆与海水相互作用而形成的特殊的地质结 构，该环境被认为与地球早期环境相似，为特异微生物群落的形成和演化提供了良好的环 境和物质基础，使得群落显示出独特的极端环境耐受力，蕴藏了大量的生物活性物质。热液 口微生物中具有很多特殊的基因和酶，在现代工业、医药、环保、材料、生物工程和国防等领 域具有广阔的开发应用前景。又因其与地球上生命形成初期的环境又十分相似，因此热液 口又被喻为是研究生命起源与进化的天然实验室。近年来宏基因组学技术体系的建立使从 不可培养微生物样品中直接获得酶资源成为可能。 宏基因组学又叫环境基因组学或群体基因组学，是指特定环境中全部生物遗传物 质的总和，利用现代基因组技术直接研究自然生态环境中的有机群落，而不需要分离、培养 单一种类的微生物。宏基因组文库的构建沿用了分子克隆的基本原理和技术方法，然后根 据不同环境样品的特点和建库目的采取了一些特殊的步骤和策略。其中主要包括以下几个 关键因素：DNA提取质量、克隆载体的选择、宿主菌的选择。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种来源于深海热液口的淀粉酶基因簇克隆子F_93基因 0RF编码的淀粉酶、其编码基因及其在工业化生产中的应用。 其一，本专利技术涉及一种淀粉酶，其特征在于，其氨基酸序列如序列表SEQ ID N0. 2 所示。 进一步地，本专利技术还涉及编码上述的淀粉酶的基因，其核苷酸序列具体为序列表 SEQ ID NO. 1 所示。 进一步地，用于所述的核苷酸序列特异性扩增的引物，包括以下两条序列： 上游引物见序列表中SEQ ID No. 3 ; 下游引物见序列表中SEQ ID No. 4 ; 进一步地，本专利技术还包括一种表达载体，所述的表达载体含有上述核苷酸片段。 进一步地，所述的表达载体，其具体为pET-32a(+)M-F_1350RFl。 进一步地，本专利技术还包括一种表达工程菌，其携带有上所述的表达载体。 进一步地，所述的表达工程菌，其具体为转化的大肠杆菌菌株BL21 (DE3)。 本专利技术所述的淀粉酶，为淀粉酶基因簇克隆子F_135的开放阅读框架0RF1编码的 基因，所述淀粉酶基因簇克隆子F_135的获得方法为：通过从热液口来源样品的宏基因组 数据中获取了含淀粉酶序列片段，通过对这些宏基因组序列信息设计引物，对2880个克隆 子进行两步法筛选，最后筛选得到克隆子F_135。 本专利技术对Fosmid克隆子F_135测序结果显示，该克隆子中含一个编码淀粉酶的放 阅读框，命名为0RF1，全长分别为1236、，其DNA序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示。蛋白 理论分子量为49. 24,其氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0. 2、所示；序列分析显示它为葡萄 糖水解酶家族蛋白（GH-57家族）。 本专利技术根据淀粉酶0RF1基因序列，设计带酶切位点的扩增引物SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4,将扩增后的到的片段酶切后与线性化的载体pET-32a(+)连接，构建表达质粒并将 其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中构建成工程菌株。通过对工程菌株培养、诱导表达、超声破 碎获得重组蛋白。 本专利技术的淀粉酶0RF1重组蛋白理论分子量分别为49. 24kD，可以在构建的工程菌 中，以包涵体形式大量表达，对包涵体进行蛋白透析复兴后，获得目标淀粉酶0RF1。 本专利技术通过DNS法，测得F_135中的0RF1的淀粉酶比活力为4. 46U/mg。由此推 断，本专利技术的淀粉酶在应用工业化生产等领域具有潜在的应用价值。 本专利技术还对所述淀粉酶进行了初步的酶学性质研究：淀粉酶F_135的0RF1最适温 度均在45°C左右，最适pH为7.0,属中性淀粉酶。另外，&1 2+、附2+、2112+、1(+对淀粉酶^^1的 活性都具有不同程度的抑制作用，值得注意的是，Mg 2+、Na+、Ca2+对淀粉酶orfl的活力均有 不同程度的促进作用，与已发现的α-淀粉酶所具有的性质一致。去污剂SDS对该淀粉酶 的催化活性有强抑制作用，Triton对它们却有一定的促进作用，而Tween20和Tween80能 部分促进激活orfl的酶活力。 与现有技术相比，本专利技术的淀粉酶较强的酶活力，对金属离子和去污剂的敏感程 度不同，在工业应用领域有很大的优势。 为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本专利技术。 【附图说明】 图1 :添加酶切位点后F_135的0RF1基因片段的PCR产物电泳结果； 1、2 :目的片段0RF1的PCR产物；M :DL2000bp的DNA分子量标准。 图2 :重组表达质粒pET-32a(+)M-F_1350RFl的构建图 图3 :淀粉酶0RF1的表达和纯化电泳图 M:蛋白分子量标准；1 :诱导前总细菌蛋白；2 :IPTG诱导后总细菌蛋白；3 :IPTG 诱导后总细菌蛋白超声沉淀；4 :IPTG诱导后超声上清总细菌蛋白；5 :纯化后的融合蛋白 BL21 (DE3)-pET32a-135_0RFl 图4为融合蛋白BL21 (DE3)-pET32a-135_orfl纯化验证结果。 Μ :蛋白分子量标准；1、2 :纯化后的融合蛋白BL21 (DE3)-pET32a-135_orfl 图5 :葡萄糖标准曲线。用以测定淀粉酶纯化酶液酶活，其中横坐标为葡萄糖含 量，纵坐标为吸光值； 图6 :pH对淀粉酶活性的影响。 图7 :温度对淀粉酶活性的影响。 【具体实施方式】 以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。 一：含淀粉酶序列克隆子的筛选。 先将深海热液口宏基因组序列与NCBI non-redundant database进行信息比对， 查找出与淀粉酶基因相似的信息；再根据注释信息查找对应的序列信息，设计特异性引物， 从文库中筛选对应的克隆子。为了提高筛选效率，将参与454测序的2880克隆分为30组， 即每个96孔板制备成一个混合质粒样品，另外再制备一个由2880个克隆混合而成的质粒 样品作为筛选时的阳性对照，就这样先以那30个混合样作为PCR扩增模板进行第一轮筛 选，找到该基因序列所对应的混合样编号，再以对应编号的96孔板为模板做第二轮筛选， 最后筛选得Fosmid本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种淀粉酶，其特征在于，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1. 一种淀粉酶，其特征在于，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示。2. 编码权利要求1所述的淀粉酶的基因，其核苷酸序列具体为序列表SEQ ID NO. 1所 /_J、1 ο3. 用于权利要求2所述的淀粉酶的基因特异性扩增的引物，包括以下两条序列： 上游引物见序列表中SEQ ID No. 3 ; 下游引物见序...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐安龙，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东;44