本发明专利技术属于基因工程领域，公开了一种高保真DNA聚合酶、编码该高保真DNA聚合酶的基因，以及该高保真DNA聚合酶的制备方法，及其在核酸扩增中的应用。本发明专利技术公开的高保真DNA聚合酶，其具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。该高保真DNA聚合酶能够扩增高GC含量的核酸模板、样品纯度较低的核酸模板，同时，也能实现对极低的模板量的扩增，大幅提高了高保真DNA聚合酶的灵敏度和扩增效率，同时具有较高的保真性，适合各类PCR及对扩增保真性要求较高的实验，也适合作为PCR扩增试剂盒中的高保真DNA聚合酶。
【技术实现步骤摘要】
一种高保真DNA聚合酶及其制备和应用
本专利技术属于基因工程领域，涉及一种高保真DNA聚合酶及其制备和应用。
技术介绍
DNA聚合酶广泛应用于分子生物学研究中，如DNA测序、标记、突变和核酸扩增等 反应。耐热DNA聚合酶由于其热稳定性，在核酸高温变性的条件下不会失活，是目前核酸扩 增的常用酶。根据序列的不同，DNA聚合酶可以分为六大族：A、B、C、D、X和Y，耐热DNA聚 合酶主要属于A族和B族，并具有相似的生物学性质。A族DNA聚合酶的代表是Taq DNA聚 合酶，该聚合酶分离自Thermus aquaticus YT-1的基因组，具有5'_3'的DNA外切酶活性 和5' -3' DNA聚合酶活性，其菌株生长于75°C左右的温泉中，由于其能耐受高温变性，自发 现后被广泛应用于PCR反应，目前已被开发成多种试剂盒；后来的研究又从其他物种中分 离出了多种A族DNA聚合酶，但由于其不具有3' -5'的外切酶校正活性，容易在扩增时掺 入错误的碱基，导致不能忠实地扩增模板，直到B族DNA聚合酶的发现，才使得高保真地扩 增模板成为可能。B族DNA聚合酶主要分离自古细菌，包括广古菌、泉古菌、纳古菌和初古 菌，其具有更高的热稳定性，同时其3' -5'外切酶校正活性能识别错误掺入延伸链中的碱 基，并将其切下，利用DNA聚合酶活性添加为与模板互补的碱基，从而保证了新扩增链与模 板的高度一致性。 超嗜热古菌具有严格厌氧和超嗜热生长的特性，如Pyrodictium和Methanopyrus 属的物种能在ll〇°C生长，而低于80°C则不能生长；从大西洋中脊3650米的超热烟囱中分 离的Pyrolobus fumarii是目前已知最耐热的古菌，其能在高达113°C的高温条件下增值， 而低于90°C则停止生长。目前已经从Pyrococcus和Thermococcus属中分离出了许多DNA 聚合酶，某些DNA聚合酶在极高的温度下仍能保持稳定，被应用于分子生物学研究，尤其是 核酸扩增中。其中，Pfu DNA聚合酶是一种来源于Pyrococcus furiosus的热稳定的DNA聚 合酶，具有5' -3' DNA聚合酶活性和3' -5'的外切酶活性。由于Pfu DNA聚合酶有3' -5' 的外切酶活性，因此在核酸扩增过程中出错的机率大大降低，保真性约为Taq DNA聚合酶的 6倍。目前，Pfu DNA聚合酶通常作为首选的高保真DNA聚合酶，用于核酸的高保真扩增，但 是，在实际应用过程中，Pfu DNA聚合酶对引物和样品的结构、纯度和浓度要求比较高，反应 灵敏度较低，扩增效率较低，限制了 Pfu DNA聚合酶的使用和推广。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种高灵敏度、高扩增效率的高保真DNA聚合 酶及其制备和应用。 为了实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下的技术方案： 本专利技术提供了一种高保真DNA聚合酶，命名为Tco DNA聚合酶，其具有（I )、（11) 所示的氨基酸序列中任意一个： ( I )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列； ( II )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸 获得的氨基酸序列。 本专利技术提供了一种Tco DNA聚合酶在核酸扩增中的应用，Tco DNA聚合酶具有 (I )、（ II )所示的氨基酸序列中任意一个： ( I )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列； ( II )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸 获得的氨基酸序列。 本专利技术提供了一种编码Tco DNA聚合酶的DNA分子，其具有I、II所示的核苷酸序 列中任意一个： I具有SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列； II具有SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得 的核苷酸序列； Tco DNA聚合酶具有（I )、（ II )所示的氨基酸序列中任意一个： ( I )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列； ( II )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸 获得的氨基酸序列。 本专利技术提供了一种重组载体，其含有编码Tco DNA聚合酶的DNA分子，该DNA分子 具有具有I、II所示的核苷酸序列中任意一个： I具有SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列； II具有SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得 的核苷酸序列； Tco DNA聚合酶具有（I )、（ II )所示的氨基酸序列中任意一个： ( I )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列； ( II )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸 获得的氨基酸序列。 优选地，上述的重组载体为含有T7启动子的重组载体。 本专利技术提供了一种PCR扩增试剂盒，其含有Tco DNA聚合酶，该Tco DNA聚合酶具 有（I )、（ II )所示的氨基酸序列中任意一个： ( I )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列； ( II )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸 获得的氨基酸序列。 本专利技术还提供一种高保真DNA聚合酶的制备方法，包括以下步骤： 获得具有编码如（I )或（II )所限定的氨基酸序列的DNA分子； 取上述DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体； 取上述重组表达载体转入宿主细胞，获得转化体； 诱导上述转化体表达融合蛋白，经分离纯化，获得高保真DNA聚合酶； ( I )为：具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列； ( II )为：具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨 基酸获得的氨基酸序列。 优选地，具有编码如（I )或（II )所限定的氨基酸序列的DNA分子，具体为具有 I、II所示的核苷酸序列中任意一个： I具有SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列； II具有SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得 的核苷酸序列。 优选地，获得具有编码如（I )或（II )所限定的氨基酸序列的DNA分子，具体为 从超嗜热古菌Thermococcus coalescens中分离、重组构建出上述的DNA分子；上述的超嗜 热古菌购自日本微生物菌种保藏中心，其保藏编号为JCM:12540,其分离自伊豆小笠原海沟 水耀海山的超高温海水中，为0. 5-2 μ Μ的不规则球形，在指数生长期时，能融合为约5 μ Μ 的融合细胞；该细菌生长于57-90°C，pH值为5. 2-8. 7,其最适pH值为6. 5,最佳生长温度为 87°C，具有超强嗜热生长特性； ( I )为：具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列； ( II )为：具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨 基酸获得的氨基酸序列。 优选地，一种高本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高保真DNA聚合酶，其特征在于，其具有(Ⅰ)、(Ⅱ)所示的氨基酸序列中任意一个：(Ⅰ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；(Ⅱ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1. 一种高保真DNA聚合酶，其特征在于，其具有（I )、（ II )所示的氨基酸序列中任 意一个： (I )具有SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列； (Π)具有SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得 的氨基酸序列。2. 如权利要求1所述的高保真DNA聚合酶在核酸扩增中的应用。3. -种编码如权利要求1所述的高保真DNA聚合酶的DNA分子，其特征在于，其具有 I、II所示的核苷酸序列中任意一个： I具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列； II具有SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核 苷酸序列。4. 一种重组载体，其特征在于，其含有如权利要求3所述的DNA分子。5. 根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，其为含有T7启动子的重组载体。6. -种PCR扩增试剂盒，其特征在于，其含有高保真DNA聚合酶； 所述的高保真DNA聚合酶，具有（I )、（ II )所示的氨基酸序列中任意一个： (I )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列； (Π)具有SEQ ID N0:1...
【专利技术属性】
技术研发人员：龙虎，狄廷娣，周裕程，万强，
申请(专利权)人：思洛生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51
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